Notch信号通路对人胰腺癌细胞NF—κB活性和侵袭能力的影响

背景：Notch信号通路在多种人类恶性肿瘤的发生、发展中起关键作用。研究显示Notch与NF—κB信号通路之间的交互作用可促进胰腺癌进展。目的：明确Notch信号通路对胰腺癌侵袭性的影响及其可能机制。方法：体外培养人胰腺癌细胞株BxPC3,以Notch-1siRNA下调其Notch-1表达,同时设置转染对照siRNA的阴性对照组和不予siRNA干扰的空白对照组。以Transwell细胞侵袭实验观察各组BxPC3细胞的侵袭能力,电泳迁移率变动分析（EMSA）检测NF—κB活性,蛋白质印迹法检测Notch-1、NF—KBp65、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP．9）蛋白表达。结果：经Notch-1siRNA干扰、Notch-1表达下调的BxPC3细胞,Transwell细胞侵袭实验穿膜细胞数较空白对照组和阴性对照组显著减少（26．5±1．3对78．5±2．4和76．7±2．2,P〈0．01）,NF—κB活性显著降低（P〈0．01）,NF-κB p65、VEGF、MMP-9蛋白表达显著下调（P〈0．05）。结论：Notch-1可通过激活NF—κB促进其下游基因VEGF、MMP-9表达,由此增强胰腺癌的侵袭性。     

RNA干扰沉默NF-κB p65基因表达抑制胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭的研究

目的 运用RNA干扰技术阻断人胰腺癌细胞株PANC1的NF-κB p65表达,观察该基因沉默后对细胞增殖能力及体外侵袭能力的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞PANC1作为siRNA组,另设无同源性siRNA转染细胞的阴性对照组和蒸馏水空白对照组.实验重复6次.应用RT-PCR检测转染细胞NF-κB p65 mRNA与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达.MTT结合克隆形成实验测定细胞生长抑制率.Matrigel细胞侵袭实验测定细胞体外侵袭能力.结果 siRNA组、阴性对照组和空白对照组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.227±0.045、0.381±0.038和0.404±0.031;ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.597±0.083、0.983±0.068和1.027±0.098;细胞生长抑制率(72 h)分别为18.3%、2.3%和0;克隆形成率分别为(14.1±3.1)%、(24.5±2.1)%和(27.2±2.6)%;侵袭细胞数分别为80.25±6.35、123.83±8.80和127.68±9.23.siRNA组均明显低于2个对照组(P＜0.01).结论 NF-κB p65的RNA干扰能抑制胰腺癌PANC1细胞NF-κB p65 mRNA和ICAM-1 mRNA的表达,抑制细胞的生长和侵袭.     

NF-κB基因对胰腺癌细胞侵袭作用的影响及机制

目的探讨NF-κB基因对胰腺癌细胞侵袭的影响及机制。方法应用NF-κB基因小于扰RNA（siRNA）转染处理人胰腺癌PANC-1细胞,采用Westernblot方法检测NF-KB蛋白水平,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞侵袭能力。收集转染48h的癌细胞,采用包含有96个转移相关基因的芯片检测基因表达情况;根据基因芯片结果,随机抽取3个表达明湿变化的基因采用荧光实时定量PCR（RT—PCR）验证基因芯片结果。结果转染组癌细胞NF-κB蛋白水平下调（P〈0．05）,且与时间和浓度相关。与对照组比较,转染组细胞的穿膜细胞数减少（P〈0．05）,且呈浓度依赖关系。基因芯片检测发现,96个基因中有11个基因表达出现明显变化,其中9个基因明显下调,包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-7和血管内皮生长因子（VEGF）,有2个基因出现明显上调。采用荧光RT—PCR方法检测MMP-2、MMP-7、VEGF基因表达,结果也发现这3个基因表达下调,且下调幅度与基因芯片结果一致。结论NF-κB基因siRNA转染可明昆抑制胰腺癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与下调MMP-2、MMP-7和VEGF有关。     

VEGF基因沉默对胰腺癌细胞化疗敏感性和Akt信号通路的影响

目的 观察靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对胰腺癌BxPC3细胞化疗药物敏感性的影响,并探讨其可能机制.方法 将培养后的BxPC3细胞分为单纯BxPC3细胞组、脂质体处理组、错配siRNA转染组和VEGFsiRNA转染组.以5、10、20、100、200 nmol/L的VEGF siRNA转染BxPC3细胞.采用实时定量RT-PCR和ELASA法检测细胞VEGF mRNA和蛋白的表达;MTT法检测吉西他滨对各组细胞生长的影响;蛋白质印迹法检测BxPC3细胞Akt蛋白的磷酸化.结果 VEGF siRNA转染后,BxPC3细胞VEGF mRNA和蛋白呈浓度和时间依赖性明显下调,但对BxPC3细胞的增殖无明显影响.用0.2 μmol/L吉西他滨处理细胞48 h后,BxPC3细胞组、错配siRNA组及5、10、20 nmol/L siRNA组细胞的生长抑制率分别为(16.9±0.3)%、(17.3±0.3)%、(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%,抑制率与siRNA浓度相关(r=0.928).同时,siRNA转染后细胞Akt蛋白的磷酸化被明显抑制.结论 VEGF基因在胰腺癌BxPC3细胞耐药中起着重要的作用,其机制可能与Akt蛋白磷酸化有关.     

RNAi抑制存活素基因表达对前列腺癌细胞侵袭的影响

目的 探讨存活素(survivin)基因对前列腺癌细胞侵袭的影响和可能机制. 方法 采用survivin基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人前列腺癌细胞系PC-3后,分别采用实时-定量RF PCR和Western blot检测survivin基因和基质金属蛋白酶家族-2、-9(matrixmetalloproteinases-2、-9)mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力;其次,将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察对癌细胞体内侵袭的影响. 结果 软琼脂集落形成试验显示,3.125、6.250 nmol/L和12.500 nmol/L siRNA组集落形成数分别为17.8±1.6、13.6±1.5、8.8±1.4,而对照组为22.65±1.8(P<0.05);Boyden小室模型试验显示,3.125、6.250 nmol/L和12.500/ nmol/L siRNA组穿过滤膜的细胞数分别为33.6±2.1、19.5±1.9、8.1±1.8,而对照组为49.4±2.3(P<0.05).体内试验显示,对照组裸鼠组织癌细胞侵袭横纹肌和血管,而转染组未见这些现象.同时发现,转染组细胞MMP-2、-9基因mRNA和蛋白水平明显下调,呈浓度和时间依赖性(P<0.01). 结论 采用survivin siRNA转染可抑制前列腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-2和MMP-9表达有关.     

葫芦巴碱通过NF-κB/MMP-9信号通路对肾细胞癌细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨葫芦巴碱对肾细胞癌细胞侵袭、迁移的影响及其可能的作用机制。方法 将786-O细胞分为：对照组、葫芦巴碱低(50μmol/L)、高剂量组(150μmol/L)、舒尼替尼组(2μmol/L)、葫芦巴碱高剂量+脂多糖(LPS)组(150μmol/L葫芦巴碱+1μg/ml LPS);CCK-8法和平板克隆实验检测细胞增殖;Transwell实验检测细胞侵袭;划痕实验检测细胞迁移;Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、核因子(NF)-κB-p65蛋白表达。以QNZ(NF-κB抑制剂)或SB-3CT(MMP-9抑制剂)与150μmol/L葫芦巴碱共处理786-O细胞48 h以验证NF-κB/MMP-9通路上下游关系;将786-O细胞悬液皮下注射到裸鼠体内,30 d后,裸鼠分为裸鼠对照组、裸鼠葫芦巴碱低(25 mg/kg)、高剂量组(50 mg/kg)、裸鼠舒尼替尼组(40 mg/kg)、裸鼠葫芦巴碱高剂量+LPS组(50 mg/kg葫芦巴碱+0.5 mg/kg LPS),给药4 w后,绘制肿瘤生长曲线,麻醉后处死裸鼠分离出肿瘤并...     

Jagged1基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990和PANC1血管相关因子分泌及迁移能力的影响

目的 以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株Jagged1基因,观察细胞VEGF、Angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌及细胞迁移能力的变化.方法 应用靶向Jagged1的siRNA、对照siRNA(c-siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1,实时PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Jagged1 mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF、angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌量,Transwell小室观察细胞的迁移能力.结果 SW1990和PANC1细胞均高表达Jagged1基因.15 nmol/L Jagged1 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,SW1990、PANC1细胞的Jagged1 mRNA表达被抑制,分别为c-siRNA组的(59.62 ±2.75)％和(76.96 ±6.16)％,Jagged1蛋白表达几乎完全被抑制.SW1990、PANC1细胞的VEGF分泌量均较c-siRNA组显著减少[(867.93±58.69) pg/ml比(1516.24±37.58)pg/ml,(951.13±120.49) pg/ml比(1413.68±33.56) pg/ml,P＜0.05],但angiopoietin2、bFGF、MMP9蛋白分泌无明显变化.另外,Jagged1 siRNA转染后,SW1990细胞VEGF mRNA表达水平为c-siRNA组的(52.26 ±4.85)％ (P＜ 0.05);PANCI细胞为c-siRNA组的(59.75±4.91)％(P＜0.05).转染后的SW1990和PANC1细胞的穿膜细胞数分别为(65.25±5.56)、(57.50±8.58)个,较c-siRNA组的( 122.25±11.09)、(112.00±12.52)个显著减少(P＜0.05).结论 人胰腺癌细胞高表达Jagged1,沉默Jagged1基因可明显抑制人胰腺癌细胞VEGF的产生和分泌,并且可降低癌细胞的体外迁移能力.     

MMP-9、TIMP-1和NF-κB在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

采用免疫组织化学和原位杂交方法检测157例甲状腺乳头状癌和30例甲状腺乳头状瘤组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)及NF-κB的表达.结果显示甲状腺乳头状癌中MMP-9及NF-κB的蛋白及mRNA表达阳性率均明显高于乳头状瘤(均P<0.01).MMP-9及NF-κB蛋白和mRNA在甲状腺乳头状癌随着病理分级增高而显著增加(P<0.01);并且颈部淋巴结有转移者均高于无转移者(P<0.01).而TIMP-1蛋白及mRNA阳性表达率与MMP-9阳性表达率相反.     

Notch和NF-κB信号通路与心肌重塑相关性研究进展

心肌重塑是心血管疾病的共同病理过程,可见于高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌病、心力衰竭等,是心血管疾病发生、发展和维持的病理基础。研究发现有多重因素参与心肌重塑的发生发展,同时这些因素相互促进,共同维持心肌重塑的发展。Notch信号通路由一组在进化上高度保守的细胞膜配体、受体及下游分子组成。细胞间受体配体作用可激活Notch信号转导过程,从而直接调节基因转录,使细胞基因表达受相邻细胞调控。Notch信号在细胞分化、胚胎发育、组织自我更新过程     

四妙勇安汤提取物抑制巨噬细胞NF-κB活化和MMP-9分泌的初步研究

目的探讨四妙勇安汤提取物对巨噬细胞核转录因子-κB(NF-κB)活化和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)分泌的作用,为开发抗不稳定型心绞痛中药的研发提供基础实验数据。方法以LPS损伤小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,ELISA法检测上清液中MMP-9的含量;同时,采用NF-κB-RE基因转染细胞,通过荧光素酶检测试剂检测细胞内NF-κB的变化,采用高通量筛选技术筛选出提取物的有效组分。结果在一定浓度范围内,1、2、3、4、6号提取物能够明显降低LPS作用后MMP-9的分泌,并具有浓度依赖关系;1、2、3、4、6、7号提取物对NF-κB信号通路具有阻断作用。结论四妙勇安汤部分提取物可抑制LPS刺激后巨噬细胞NF-κB信号通路,同时减轻MMP-9的分泌,这一作用可能与其抗冠心病不稳定心绞痛的作用相关。     

siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-9蛋白表达的影响

目的 利用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制人舌癌Tca8113细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,观察其对培养细胞和移植瘤基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达的影响.方法 以稳定转染携带VEGF-siRNA真核表达载体的人舌癌Tca8113细胞(VEGF-siRNA1、VEGF-siRNA2)为实验组,以转染空载体人舌癌Tca8113细胞及未转染的人舌癌Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组,将各组细胞分别接种于裸鼠皮下,用免疫细胞/组织化学法分别测定各组培养细胞和移植瘤VEGF及MMP-9的蛋白表达.结果 在培养细胞和移植瘤中,与实验对照组和空白对照组相比,VEGF-siRNA1组和VEGF-siRNA2组VEGF染色平均灰度值高,差异有统计学意义(P＜0.05);各组培养细胞中均未见MMP-9表达;各组移植瘤MMP-9染色平均灰度值之间的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 以siRNA干扰沉默人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制细胞及移植瘤内VEGF蛋白表达,但是对MMP-9蛋白的表达无明显影响.     

S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响

目的 探讨S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响和可能机制。方法 将不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的靶向S100A6的小干扰RNA( S100A6-siRNA)转染人胰腺癌BxPC3细胞,分别采用荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测S100A6 mRNA和蛋白的表达,采用Transwell小室检测癌细胞侵袭能力,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性。结果 S100A6-siRNA转染组细胞的S100A6 mRNA和蛋白表达呈浓度、时间依赖性明显下调,穿膜细胞数呈浓度依赖性明显减少。12.5 nmol/L的S100A6-siRNA转染组细胞转染后48 h的S100A6 mRNA表达从对照组的(100±0.3)％降到(15.3±0.2)％(P＜0.01);S100A6蛋白的表达从(83.2±0.18)％降到(13.5±0.12)％(P＜0.01);穿膜细胞数从(44.5±2.2)个降到(7.6±1.5)个(P＜0.05)。同时,S100A6-siRNA转染组细胞的MMP-9活性明显下调。结论 抑制S100A6基因表达可抑制胰腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-9活性有关。     

TLR4/NF-κB信号通路在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞分泌MCP-1中的作用

目的:探讨Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路在氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)分泌单核细胞趋化因子-1(MCP-1)中的作用。方法:取SD大鼠胸主动脉中膜培养血管平滑肌细胞,以2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L的TLR4中和抗体(TLR4阻断剂)、5μmol/L、10μmol/L、、20μmol/LPDTC(NF-κB特异性阻断剂)分别进行干预,并分别设置空白对照组和ox-LDL组,观察其对血管平滑肌细胞中ox-LDL诱导的MCP-1表达的影响。结果:与空白对照组比较,ox-LDL组VSMCs MCP-1mRNA及蛋白的表达明显升高(P<0.05);与ox-LDL组比较,用TLR4中和抗体预孵育后Anti-TLR4三组MCP-1mRNA[(1.23±0.21)比(0.81±0.02)、(0.75±0.01)、(0.49±0.01)]及其蛋白的表达[(0.64±0.05)ng/ml比(0.41±0.12)ng/ml、(0.32±0.07)ng/ml、(0.21±0.02)ng/ml]明显降低(P均<0.01),且呈浓度依赖性;用PDTC预孵育后PDTC三组MCP-1mRNA[(1.37±0.19)比(1.02±0.08)、(0.87±0.01)、(0.56±0.02)]及其蛋白的表达[(0.65±0.07)ng/ml比(0.51±0.07)ng/ml、(0.30±0.08)ng/ml、(0.19±0.02)ng/ml]亦明显降低(P均<0.01),且呈浓度依赖性。结论:氧化性低密度脂蛋白是TLR4的内源性配体;氧化性低密度脂蛋白通过或部分通过TLR4/NF-κB信号通路介导血管平滑肌细胞单核细胞趋化因子-1的表达。     

雷公藤内酯醇对胰腺癌PANC1细胞Toll样受体4/核因子-kB信号通路的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇(TP)对人胰腺癌PANC1细胞株侵袭能力的影响及其与Toll样受体4/核因子-KB(TLR4/NF-KB)信号通路的关系.方法 将PANC1细胞分为亲本细胞组、TP组、脂多糖(LPS)组和TP+ LPS组.TP组培养液中加入50 ng/ml的TP,LPS组加入1μg/ml的LPS,TP+ LPS组先用50 ng/ml的TP处理2h,再加入1 μg/ml的LPS.各组细胞均常规培养24 h.采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测TLR4、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和蛋白的表达,双荧光素酶报告基因系统检测NF-KB活性,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 亲本组、LPS组、TP组、TP+ LPS组的TLR4mRNA表达量分别为0.41 ±0.06、0.46±0.10、0.20±0.04和0.25±0.06,TLR4蛋白表达量分别为0.55±0.06、0.60±0.03、0.18±0.04和0.13±0.00;NF-KB活性分别为13.0±3.0、31.6±4.3、7.3±1.5和10.8±2.1;穿膜细胞数分别为(56.8±8.6)、(104.5±12.8)、(32.0±5.7)和(46.8±7.0)个;MMP-9mRNA表达量分别为0.36±0.05、0.58 ±0.07、0.18±0.03和0.30±0.004,MMP-9蛋白表达量分别为0.31±0.04、0.53±0.08、0.11±0.02和0.15±0.00.LPS组TLR4 mRNA和蛋白表达量与亲本组差异无统计学意义,但NF-KB活性、穿膜细胞数、MMP-9 mRNA和蛋白表达量显著高于亲本组(t值分别为8.654、7.593、6.655、4.982,P值均＜0.01).TP组TLR4 mRNA和蛋白表达量、NF-KB活性、穿膜细胞数、MMP-9 mRNA和蛋白表达量均显著低于亲本组(t值分别为-7.609、-9.948、-4.176、-5.915、-8.179、-9.948,P值均＜0.01).TP+ LPS组TLR4 mRNA和蛋白表达量、NF-KB活性、穿膜细胞数、MMP-9 mRNA和蛋白表达量均显著低于LPS组(t值分别为-4.437、-14.805、-10.506、-9.700、-9.055、-8.932,P值均＜0.01).结论 TP具有抑制胰腺癌细胞侵袭的作用,其机制与抑制TLR4/NF-kB信号通路、下调MMP-9的表达有关.     

氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990侵袭转移能力的影响

目的 探讨氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990体外迁移及侵袭能力的影响及其作用机制.方法 体外培养人胰腺癌SW1990细胞株,用氧化苦参碱处理SW1990细胞后,采用MTT法检测细胞增殖;通过细胞黏附实验、细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的黏附、迁移及侵袭能力;RT-PCR法检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;ELISA法检测细胞VEGF蛋白的含量.结果 氧化苦参碱呈剂量和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖.2 mg/ml氧化苦参碱处理SW1990细胞1 h后,细胞的体外黏附抑制率为(35.23 ±8.56)%;处理24 h后,细胞的过河时间为(65.46±4.25)h,较对照组的(34.50±4.12)h显著延长(P<0.05);穿膜细胞数为(91.9±9.6)个,较对照组的(144.2±17.2)个显著减少(P<0.05);细胞VEGF、MMP-2 mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌量均显著下调[0.515 ±0.063比0.817±0.054,0.343±0.072比0.650±0.068,(265.50 ±5.45)pg/ml比(441.06±16.70)pg/ml,P值均<0.05].结论 氧化苦参碱可能通过抑制MMP-2和VEGF表达进而抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.     

内脂素经核因子κB途径诱导人单核细胞基质金属蛋白酶-2和9表达的实验研究

目的 探讨内脂素对核因子κB(NF-κB)通路的激活及其在调节人单核细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达中的作用,以期进一步了解内脂素与动脉粥样硬化的关系.方法 以健康人外周血单核细胞为研究对象.抽取健康志愿者静脉血,分离、纯化单核细胞后随机分为空白对照组;内脂素组(100、200、400 ng/ml,24 h);Bay11-7082抑制剂组(Bay11-7082 40μmol/ml预孵育30 min,内脂素400 ng/ml刺激24 h).荧光定量PCR检测各组细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表达;Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白的表达;明胶酶谱法检测细胞培养基质中MMP-2和MMP-9的酶活性.内脂素刺激细胞后的核转位分别用Western blot和ELISA进行检测.结果 人外周血单核细胞经不同浓度的内脂素干预培养后24 h单核细胞MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白的表达均明显高于空白对照组(P均<0.05),且呈浓度依赖性.内脂素还上调细胞分泌到细胞培养基中的MMP-2和MMP-9酶活性,内脂素100 ng/ml组MMP-9、MMP-2的酶活性分别为空白对照组的(1.139 ±0.055)和(1.102±0.011)倍(P均<0.05).加入NF-κB抑制剂Bay11-7082后MMP-2、MMP-9的mRNA、蛋白的表达及酶活性均明显低,与内脂素400ng/ml组比较差异均有统计学意义(P均<0.001).内脂素浓度越高,核蛋白NF-κBp65表达越高,内脂素100 ng/ml组相对灰度值为空白对照组的(1.334±0.148)倍(P均<0.05);内脂素浓度越高,NF-κBp65亚单位核内转移越多,内脂素100ng/ml组为0.763±0.056,内脂素400 ng/ml组为1.290±0.065,均大于对照组的0.467±0.046(P均<0.05).结论 内脂素可通过激活NF-κB途径上调人单核细胞中MMP-2和MMP-9表达及活性.这可能是内脂素致动脉粥样硬化及与急性冠状动脉综合征密切相关的机制之一.     

三羟异黄酮抑制胰腺癌细胞Notch-1和Hedgehog信号通路活性

目的 探讨三羟异黄酮对胰腺癌BxPC3细胞Notch-1和Hedgehog信号通路分子SHH和HHIP表达以及对细胞周期和增殖的影响.方法 体外培养胰腺癌BxPC3细胞,三羟异黄酮作用BxPC3细胞后,提取总RNA和蛋白质.RT-PCR方法检测Notch-1 mNRA、SHH mRNA和HHIP mRNA表达,Western blotting方法检测Notch-1和SHH蛋白的表达.MTT方法检测BxPC3细胞的增值,流式细胞术和PI单染法分析细胞的周期.结果 20μg/ml的三羟异黄酮处理BxPC3 48 h后,细胞增殖抑制率为(67.17±2.32)%.Notch-1 mRNA表达从2.454±0.068下调到1.304±0.169;SHH mRNA表达从0.959±0.023下调到0.472±0.077;而HHIP mRNA表达从0.625±0.158增加到1.761±0.121.Notch-1蛋白表达从1.361±0.109下调到0.760±0.114;SHH蛋白表达从0.265±0.018下调到0.129±O.013.(52.77±9.47)%的细胞被阻滞在G2/M期.结论 三羟异黄酮能同时抑制Notch-1的表达和阻断Hedgehog信号通路,并抑制胰腺癌细胞的增殖.     

VEGF和MMP-9在胰腺癌侵袭转移中的表达及临床意义

目的:分析血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9.MMP-9)在胰腺癌中的表达,探讨血管生成在肿瘤侵袭转移中的差别及意义.方法:选取35例胰腺癌及其癌旁组织、正常组织标本,应用免疫组化方法检测VEGF、MMP-9表达和微血管密度(microvessel density,MVD)计数,并结合病理特点进行分析.结果:VEGF、MMP-9表达阳性率胰腺癌组织较癌旁组织、正常组织差异有统计学意义(VEGF:77.14% vs 5.71%,12.86%,P＜0.01;MMP-9:68.57% vs 8.57%,5.71%,P＜0.01):在大小为＜2 cm、2-4 cm和＞4 cm肿瘤VEGF的阳性率分别为42.86%、92.86%和78.57%.MMP-9的阳性率分别为28.57%、75.00%和83.33%;分化程度高、中、低肿瘤VEGF的阳性率分别为71.43%、70.59%和90.91%,MMP-9的阳性率分别为71.43%、64.71%和72.73%,差异均有统计学意义(P＜0.05).VEGF、MMP-9阳性率在淋巴转移阳性组分别为100%、95.24%,胰腺癌VEGF、MMP-9阳性组与阴性组MVD平均值比较,差异均有统计学意义(t=3.23,P＜0.01;t=3.89,P＜0.01).结论:VEGF、MMP-9与胰腺癌的高血管生成活性相关,VEGF、MMP-9有望成为抗胰腺癌侵犯转移治疗的靶蛋白.     

干扰Sema4D基因表达对胰腺癌细胞生物学特征的影响

目的探讨干扰Sema4D基因的表达对胰腺癌细胞生物学的影响。方法设计合成Sema4D-siRNA,转染到人胰腺癌细胞系中,将实验分为3组,转染siRNA组、阴性对照组(即转染非特异性对照组)﹑空白对照组(未经任何处理的胰腺癌细胞)。转染48 h后利用RT-q PCR检测转染前后Sema4D mRNA表达的变化,转染72 h后利用Western-Blot的方法检测转染前后Sema4D蛋白表达的变化;采用四甲基偶氮唑蓝显色法观察转染后细胞生长变化;Transwell小室侵袭试验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变;采用流式细胞技术检测肿瘤细胞凋亡的变化。计量资料多组间比较采用单因素方差分析比较,进一步两两比较采用LSD-t检验法。结果转染Sema4D-siRNA 48 h后,转染siRNA组Sema4D mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组,3组比较差异有统计学意义(F=421.990,P<0.001)。转染Sema4D-siRNA 72 h后,转染siRNA组Sema4D蛋白明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异有统计学意义(F=27.074,P=0.002 3)。转染siRNA组48、72、96 h的细胞生长速度明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异均有统计学意义(F值分别为15.314、62.255、223.493,P值分别为0.004、<0.001、<0.001)。转染siRNA组穿膜细胞个数明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异有统计学意义(42.0±5.9 vs 60.0±6.1 vs 61.0±4.6,F=37.21,P=0.000 4]。转染siRNA组穿膜细胞凋亡率明显低于阴性对照组和空白对照组,3组间比较差异有统计学意义[(16.57±0.31)%vs(9.50±0.45)%vs(9.90±0.61)%,F=26.75,P=0.007 4]。结论 siRNA能够下调Sema4D基因在胰腺细胞中的表达,可以抑制胰腺癌细胞增殖,使胰腺癌细胞侵袭能力明显下降,凋亡率下降。     

整合素β1基因沉默对胰腺癌细胞PANC1体外侵袭能力的影响及机制研究

目的 应用短发夹RNA(shRNA)沉默人胰腺癌细胞株PANC1的整合素α1(integrinβ1)基因表达,观察其对PNAC1细胞体外侵袭能力的影响,探讨其机制.方法 构建靶向integrinβ1基因的shRNA真核表达质粒integrinβ1-shRNA及对照真核表达质粒c-shRNA,转染人胰腺癌PANC1细胞,以未转染质粒的细胞作为对照组.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测integrinβ1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平,应用Transwell侵袭小室检测细胞体外侵袭能力.结果 integrinβ1-shRNA 组、c-shRNA组和对照组细胞integrinβ1 mRNA表达量分别为0.0029±0.0004、0.0131±0.0009、0.0138±0.0005;integrinβ1蛋白表达量为0.0159±0.0062、0.3215 ±0.0126、0.3107±0.0094.integrinβ1-shRNA 组integrinβ1 mRNA和蛋白表达抑制率分别为(78.6±7.2)％和(92.9±3.2)％(P＜0.01).而c-shRNA 组与对照组差异无统计学意义(P =0.2999).integrinβ1-shRNA组穿膜细胞数由(52±5)个降低至(21 ±4)个(P＜0.01);MMP-2和MMP-9mRNA表达分别从0.592±0.073和0.847±0.069降低到0.102±0.034和0.273±0.071;MMP-2和MMP-9蛋白表达分别从0.225±0.046和0.416±0.081降低到0.059±0.013和0.106±0.022(P值均＜0.05).结论 重组质粒integrinβ1-shRNA能有效地抑制PANC1细胞integrinβ1基因的表达,并可能通过下调MMP-2和MMP-9基因表达而抑制其体外侵袭能力.