HBV DNA定量检测及临床应用的研究进展

ＨＢＶ ＤＮＡ是乙型肝炎病毒感染最直接和可靠的标志。本文就目前几种ＨＢＶ ＤＮＡ定量检测方法，它们相互比较及临床应用作一综述。     

PCR检测HBV DNA评价HBsAg阴性血液的传染性

为评价ＨＢｓＡｇ阴性血液的传染性，使用ＰＣＲ技术检测了ＨＢｓＡｇ阴性的８０例普通患者和１０３例传染患者的ＨＢＶ ＤＨＡ，并对不同ＨＢＶ感染模式进行分析。     

DNA浓缩液在HBV DNA检测中的价值

目前检测HBV DNA浓度广泛应用实时荧光定量PCR技术,该方法具有高敏感性、特异性和重复性。在样品前处理中,HBV DNA提取多采用热裂解法,但一些病例抗HBc lgG与抗HBc lgM同时阳性且肝功能有不同程度的异常,而HBV DNA却是阴性,为使低拷贝DNA样品不致漏诊,本文在DNA提取中,加入了DN     

高灵敏度HBV DNA检测在乙型肝炎相关性肝细胞肝癌中的临床应用价值研究

目的通过对血清低病毒载量HBV DNA(<1 000 IU/mL)乙型肝炎相关性肝细胞肝癌(HCC)患者检测,探讨乙型肝炎病毒血清高灵敏度HBV DNA检测水平对乙型肝炎相关性肝细胞肝癌临床治疗的帮助。方法选取2016年2月至2018年10月在江汉大学附属湖北省第三人民医院门诊和住院的,普通荧光探针法HBV DNA水平持续小于1 000 IU/mL的96例HCC患者血清,进行血清高灵敏度HBV DNA检测,分析患者血清免疫学标志、肝功能指标与HBV DNA水平的相关性和临床意义。结果 96例乙型肝炎相关性HCC患者当中,HBV DNA水平大于10 IU/mL有74例(77.1%)。HBV DNA水平大于10 IU/mL者的肝硬化发生率、肝功能指标(ALT、γ-GT)异常率均较HBV DNA水平小于10 IU/mL者高。结论乙型肝炎相关性HCC与乙型肝炎病毒持续复制有关,高灵敏度HBV DNA检测较普通荧光探针法HBV DNA检测更有临床指导意义。     

聚合酶链反应检测HBV DNA在HBV不同血清免疫学标志组合中的应用价值

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一种世界性传染病,我国为高流行区, 约1亿人口为乙型肝炎表面抗原携带者。     

乙肝血清HBV标志定量与HBV DNA的关系及临床意义

目的探讨乙型肝炎患者的乙肝病毒标志(HBVM)定量与HBVDNA检出的相关性及临床意义.方法对389例各型乙肝患者用放射免疫定量分析测定HBVM,用聚合酶链反应法测定HBVDNA.结果HBVDNA在乙型肝炎患者血清中总检出率为51.93%,并以重型肝炎、急性乙型肝炎为最高;慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化其次,淤胆型肝炎为最低;HBeAg阳性组与抗-HBe阳性组HBVDNA检出率分别为84.76%和34.37%,(P＜0.001).结论HBsAg、HBeAg的含量与HBVDNA检出率有明显相关性,可用HBeAg替代HBVDNA的检测.     

定量聚合酶链反应检测慢性乙型和丁型肝炎患者血清HBV DNA

本研究应用新型定量PCRHBV检测法—AcuGenAmplisensorTMHBV法对70例慢性乙型与丁型肝炎病例进行血清HBVDNA水平测定，观察乙肝在丁肝病毒重叠感染时是否对HBVDNA复制存在抑制作用。实验结果：乙肝组（34例）及丁肝组（36例）定量PCR测HBVDNA阳性率为88．2％（30/34）和91．7％（33/36）（P＞0．05）。乙肝组HBeAg阳性与抗HBe阳性病例之HBVDNA复制水平无明显差异；而丁肝组则表现明显性差异（P＜0．01）。结果提示：本组丁肝重叠乙肝感染病例中血清HBVDNA复制被抑制的现象并不明显，其中HBeAg阳性病例HBVDNA大多处于高水平复制状态；而抗HBe阳性病例则以低水平复制为主，提示肝炎病情活动和慢性化趋向与病毒复制有密切关系，定量PCR检测HBVDNA的技术可以为该领域研究提供有效手段。     

ABI-7000 PCR仪对血清HBV DNA含量的定量分析

目的检验ABI-7000荧光定量PCR仪对血清HBV DNA检测的灵敏性和重复性,探讨HBV DNA定量与血清标志物的关系,比较荧光定量PCR与定性PCR的敏感性差异。方法对乙肝标志物已明确的305例血清进行HBV DNA定量检测,其中67例同时做HBV DNA定性,并对结果进行统计分析。结果ABI-7000荧光定量PCR仪检测HBV DNA的灵敏性高,可检测低至1000copies/ml血清,批内及批间cv值分别为9.16%及12.66%;各种血清标志物组合HBV DNA含量分布情况表明:HBeAg阳性组HBV DNA阳性率高于其它组合(p<0.05);荧光定量PCR组HBV DNA阳性率与定性PCR组比较,有显著性差异(p<0.05)。结论ABI-7000PCR仪定量检测HBV DNA,灵敏度高,重复性好,优于传统定性PCR;HBV DNA定量可准确反映体内HBV复制情况,具有重要临床意义。     

慢性乙型肝炎病毒感染者前C区变异及HBV DNA载量的临床意义

目的探讨慢性HBV感染者前C区A1896变异及HBVDNA载量与肝炎病情进展的关系。方法检测116例慢性HBV感染者前C区A1896变异,比较不同临床类型前C区A1896变异阳性率,再根据前C区变异不同,比较不同临床类型HBVDNA含量的差异。结果不同临床类型前C区变异株检出率差异无统计学意义(χ2=2.863,P=0.581)。在慢性HBV携带者中,变异阳性率同时伴有较高水平的HBVDNA量(P=0.003),其余各临床类型均未见明显差异;但变异情况相同的条件下,HBVDNA载量似随着病情的加重呈降低趋势。结论影响肝炎病情进展的因素错综复杂,前C区A1896变异可能不起作用,但前C区A1896变异可能是影响HBVDNA复制的一个因素。     

定量聚合酶链反应检测血清乙型肝炎病毒DNA及其意义

采用定量ＰＣＲ技术检测了１４０例病毒性肝炎患者及３１例ＨＢｓＡｇ携带者血清乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ基因含量。结果显示１２３例乙型肝炎患者及３１例ＨＢｓＡｇ携带者血清ＨＢＶＤＮＡ基因含量范围在１０１至１０９拷贝／微升，１７例其它类型肝炎及３０例健康正常人均未检出ＨＢＶＤＮＡ；与定性ＰＣＲ及分子斑点杂交检测比较，定量ＰＣＲ的灵敏度更高。该方法是一种快速、敏感、特异的定量ＰＣＲ技术，可用于乙型肝炎的临床诊断和实验研究。     

乙肝血清标志物与HBV-DNA检测结果的相关性分析

目的:探讨乙肝血清标志物与HBV-DNA检测结果的相关性,以及二者联合检测在临床诊断中的应用。方法:收集1445例乙肝患者血清,同时采用电化学发光免疫分析法检测乙肝血清标志物和实时荧光定量PCR技术检HBV-DNA拷贝数。结果:HBsAg阳性HBeAg阳性组的HBV-DNA阳性率高于HBsAg阳性HBeAg阴性组和HBsAg阴性HBeAg阴性组(P<0.01),且HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)类型中病毒载量集中在高拷贝区段,但在HBeAg阳性者中仍有部分HBV-DNA为阴性(10.9%),而在HBsAg阳性HBeAg阴性组中HBV-DNA阳性率仍有25.5%。结论:HBeAg阳性是反映病毒复制的良好指标,但无正相关;仅依靠乙肝血清标志物检测不能很准确地判断HBV复制的程度及其传染性的强弱;乙肝血清标志物与HBV-DNA检测的结合能更好地为临床提供准确可靠的诊断数据。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.

Abstract：

Objective To establish and optimize a sensitive and specific quantitative realtime polymerase chain reaction(PCR)method for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA(HBV cccDNA)in liver tissue. Methods Specific primers and probes were designed to detect HBV DNA(tDNA)and cccDNA. A series of plasmids(3.44 × 100-3.44 × 109 copies/μl)containing a full double-stranded copies of HBV genome(genotype C)were used to establish the standard curve of real-time PCR. Liver samples of 33 patients with HBV related hepatocellular carcinoma(HCC), 13 Chronic hepatitis B patients(CHB)and 10 non-HBV patients were collected to verify the sensitivity and specificity of the assay. A fraction of extracted DNA was digested with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase(PSAD)for HBV cccDNA detection and the remaining was used for tDNA and β-globin detection. The amount(copies/cell)of HBV cccDNA and tDNA were measured by a real-time PCR, using β-globin housekeeping gene as a quantitation standard. Results The standard curves of real-time PCR with a linear range of 3.44 × 100 to 3.44 × 109 copies/μl were established for detecting HBV cccDNA and tDNA, and both of the lowest detection limits of HBV cccDNA and tDNA were 3.44 × 100 copies/μl. The lowest quantitation levels of HBV cccDNA in liver tissues tested in 33 HBV related HCC patients and 13 CHB patients were 0.003 copies/cell and 0.031copies/cell, respectively. HBV cccDNA and tDNA in liver tissue of 10 non-HBV patient appeared to be negative. The true positive rate was increasing through the digestion of HBV DNA by PSAD, and the analytic specificity of cccDNA detection improved by 7.24 × 102 times. Liver tissues of 2 patients were retested 5 times in the PCR for detecting cccDNA and the coefficience of variations on cycle threshold (Ct)were between 0.224%-0.609%. Conclusion A highly sensitive and specific quantitative real time PCR method for the detection of HBV cccDNA in liver tissue was established and could be used for clinical and epidemiological studies.     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×10⁰-3.44×10⁹copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 10⁰-3.44×10⁹ copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×10⁰copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 10²倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.     

慢性乙型肝炎临床表现形式与乙肝病毒基因型的关系分析

目的:探讨慢性乙型肝炎基因型与慢性乙型肝炎临床表现类型的关系。方法:对35例慢性乙型肝炎轻度,32例慢乙肝中度以及30例慢乙肝重度患者的血清采用荧光定量PCR技术进行乙肝病毒基因型的检查,分析慢性乙型肝炎的三种表现与乙肝病毒基因型的关系。结果:97例慢性乙肝患者共检出B型基因为39例(40.21%),C型基因为58例(59.79%),在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度各组间基因型B和C分布差别无统计学意义(P>0.05),B和C基因型中HBeAg和HBV-DNA载量的表达有差别(P<0.05),C基因型的HBeAg和HBV-DNA载量表达要高于B基因型。结论:本地区慢性乙型肝炎基因型以B和C感染为主,基因型与慢性乙型肝炎轻、中、重分级无关系,C型基因的HBeAg和HBV-DNA载量表达要高于B基因型。     

乙型肝炎患者血清中HBVDNA含量与HBV血清学标志关系

[目的 ]　探讨乙型肝炎患者血清中HBVDNA含量与HBV血清学标志的关系。 [方法 ]　测定不同乙肝血清学标志模式和 2 47份标志物全阴性的临床肝炎病人血清以半套式PCR荧光定量检测系统检测HBVDNA含量。 [结果 ]　在HBsAg、HBeAg阳性的血清中HBVDNA含量最高 ,血清HBeAg和HBVDNA含量密切相关。但在很少数HBeAg阳性血清中未能检出HBVDNA。在另外的乙肝血清标志物模式中 ,包括全阴性和抗HBs阳性 ,也有少数血清标本能检出HBVDNA ,其浓度分布的范围很广。 [结论 ]　少数血清HBsAg、HBeAg阳性的病人并不处于HBV活跃复制的状态。PCR定量检测HBVDNA含量更有助于乙肝的预后和抗病毒疗效的监测。     

HBIG抑制HBsAg、HBV DNA分泌的体外实验研究

目的研究乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）对肝细胞的跨膜转运作用和对乙型肝炎病毒（HBV）感染细胞模型的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、HBVDNA分泌的抑制作用。方法用含HBIG的培养基培养QSG7701细胞，在不同时间点定量检测培养上清的抗HBs，计算HBIG的透过率；用含HBIG的培养基培养HepG2．2．15细胞数天，或先以，定浓度的HBIG共培养，第3天后更换为不含HBIG的培养基继续培养细胞。于不同时间点定量检测培养上清的HBsAg、HBV DNA；用MTT比色试验观察药物的细胞毒性。结果浓度为0.1～0.4IU／mL的HBIG与QSG7701细胞共孵育48h时，细胞内约有38％～46％的HBIG。浓度为0．1～10.0IU/mL的HBIG作用第3、6．9天时能抑制HepG2，2．15细胞培养上清中HBsAg、HBV DNA的分泌（P〈0．01）。住尤药物继续培养的第5、7天，培养卜清中HBsAg浓度较有药物培养的第3天低且继续下降（P〈0．01），第9～11天逐步增高；培养上清HBV DNA水平在第5天时也较有药物培养的第3天低并继续下降（P〈0．01），第7～11大时逐步增高。结论在体外细胞实验中，HBIG能跨膜转运入肝细胞内，细胞内外的HBIG能抑制HBsAg、HBV DNA的分泌。     

乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变对血清HBV DNA含量的影响

目的利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变,探讨前C区/BCP区基因突变后血清HBV DNA水平的变化。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙肝的HBV前C区1896、1814及HBV C基因启动子(BCP)1762、1764四位点突变,同时用荧光定量PCR检测血清HBV DNA含量。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中G1896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其它各组则无显著变化。结论应用基因芯片法可同时检测HBV多个突变位点。乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变对血清HBV DNA含量有一定的影响。     

DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因型

目的 制备检测HBV基因型的DNA芯片并进行杂交验证.方法 设计多条HBV分型寡核苷酸探针,固定于醛基基片的特定位置,制备成芯片,采用酶呈色技术(BCIP/NBT显色)检测杂交信号,进行杂交验证分析.结果 106例临床样本均测出基因型,其中B型37例,C型69例;对所有样本进行测序分析,结果与芯片杂交一致,杂交的灵敏度和重复性等指标均佳.结论 DNA芯片检测HBV基因型,操作简便易行,技术要求不高,适于临床推广应用.