昆虫抗冻蛋白MpAFP149抗血清的制备及转基因烟草免疫定位的检测

目的:制备昆虫抗冻蛋白MpAFP149特异性抗血清,以便从细胞水平阐明昆虫抗冻蛋白在转基因烟草中的功能基础。方法:将具有完整读码框的MpAFP149基因连接到真核表达载体pcDNA3上,用做DNA免疫质粒。另外,将编码成熟肽的抗冻蛋白基因片段MpsAFP149插入原核表达载体pGEX-4T-1中,形成的重组质粒pGEX-4T-1-MpsAFP149转化大肠杆菌BL21(DE3),获得融合蛋白GST-sAFP149,用于蛋白免疫。采用"DNA初免-蛋白质加强"的策略免疫小鼠,制备抗血清,Western blot检测抗血清的特异性。制备野生型和转有MpAFP149转基因烟草叶片的超薄切片,利用免疫胶体金技术检测异源抗冻蛋白的表达及亚细胞水平的表达定位。结果:构建了昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149的原核和真核表达载体;获得了预期的相对分子质量(Mr)约为36 000的融合蛋白。Western blot和转基因烟草的免疫定位结果表明此免疫策略可使小鼠产生特异性的昆虫抗冻蛋白抗血清。抗冻蛋白MpAFP149在转基因烟草中得到了表达并主要分布植物细胞质外体中的细胞壁上。结论:含有抗冻蛋白基因MpAFP149的真核表达质粒pcDNA3-MpAFP149和融合蛋白GST-sAFP149,通过"DNA初免-蛋白质加强"的免疫策略,可使小鼠产生专一性的抗血清。该抗血清可有效地用于抗冻蛋白基因MpAFP149转基因烟草的免疫定位研究。     

小鼠抗人前B细胞白血病同源盒基因3多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)多克隆抗体。方法采用反转录PCR扩增PBX3基因区序列,并重组入原核表达载体pGEX-4T-1,重组载体转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-PBX3融合蛋白的表达。SDS-PAGE纯化融合蛋白,并用GST-PBX3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,收集经过免疫的小鼠血清即抗PBX3的多克隆抗血清,采用间接ELISA检测其效价,通过免疫细胞化学技术及Western blot法鉴定其特异性。结果成功构建pGEX-4T-1/PBX3原核表达载体,转化BL21菌株后可高效表达GST-PBX3融合蛋白,且以不可溶包涵体形式存在。SDS-PAGE纯化蛋白并免疫小鼠产生的抗PBX3血清可特异识别细胞外源过表达的PBX3蛋白,同时可检测到细胞外源性PBX3蛋白的细胞内定位情况。结论获得效价和特异性良好的PBX3多克隆抗体。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备

目的:制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清。方法:根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi:2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达。表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot进行检测。结果:SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38000的可溶性融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶5000,Western blot证实BL21/pGEX-4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合。结论:在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础。     

我国地方品种鸡IL-17cDNA的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种鸡IL-17 cDNA,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性。方法:利用特异性引物,通过RT-PCR方法扩增得到隐性白羽鸡IL-17(ChIL-17)的基因片段,PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-ChIL17。将重组质粒pGEX-6P-1-ChIL17转化E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果:成功扩增出ChIL-17基因片段,大小约510 bp,序列与GenBank登录的序列(NM 204460)相比,核苷酸同源性为99.8%,第477位碱基由G变为A,氨基酸同源性为100%。酶切鉴定结果表明,ChIL-17基因正确克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中。重组质粒pGEX-6P-1-ChIL17在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出Mr约46 000大小的目的蛋白表达条带;Western blot结果表明,表达产物与小鼠IL-17抗体具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达出我国地方品种鸡ChIL-17基因,为抗ChIL-17单...     

人GRP78蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原.     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的蛋白酶体激活亚单位3（PA28γ）的表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA28γ蛋白，经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体；将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），诱导表达PA28γ蛋白，通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白（GST-PA28γ）；并用其免疫BALB／c小鼠制备多抗血清，对表达产物和多抗血清进行Westem-blot鉴定。结果成功构建原核表达质粒PA28γpGEX-4T-1。且测序正确；获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清，并得到Westem-blot证实。结论成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清，为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

人磷脂转移蛋白的原核表达及其抗体的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌表达人磷脂转移蛋白(PLTP),制备兔抗人PLTP的多克隆抗血清。方法采用RT-PCR技术,将人PLTP蛋白编码序列克隆入pET-30b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备PLTP抗血清。用间接ELISA法、Western blot、细胞免疫荧光检测对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果SDS-PAGE分析表明,PLTP基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为3h;将纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶256000;Western blot及细胞免疫荧光检测显示,抗血清可以与PLTP原核及真核表达蛋白特异结合。结论成功地将PLTP进行了原核表达,制备了高效价、高特异性的兔抗人PLTP抗血清,为PLTP的临床检测及其结构与功能的进一步研究提供了有力工具。     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体（FcεRⅡ）基因的原核表达系统。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FcεRⅡcDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体FcεRⅡ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FcεRⅡ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FcεRⅡ的表达。结果测序表明所扩增FcεRⅡcDNA基因,与已报道的序列一致。获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合。结论成功构建了FcεRⅡ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人IgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FcεRⅡ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础。     

小鼠OCILrP2基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

目的：在原核系统中表达破骨细胞抑制凝集素家族成员之一OCILrP2基因,并制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。方法：应用RT-PCR从小鼠脾细胞中克隆的部分OCILrP2cDNA,构建重组表达载体pET-28a-OCILrP2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达His-OCILrP2融合蛋白。以表达产物免疫SD大鼠,制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。采用Western blot测定其效价和特异性。结果：RT-PCR法扩增出235bp的OCILrP2基因,其cDNA序列与GenBank中登录的序列一致。以构建的重组质粒pET-28a-OCILrP2转化大肠杆菌获得目的蛋白的高表达。以表达的His-OCILrP2融合蛋白免疫大鼠获得抗小鼠OCILrP2的抗血清。Western blot分析表明,该抗血清均可与原核表达的His-OCILrP2融合蛋白和真核表达的OCILrP2-Ig融合蛋白特异性结合;抗血清的效价为1∶2000。结论：在原核细胞中表达了小鼠的OCILrP2蛋白,制备了大鼠抗小鼠OCILrP2的抗血清,为进一步研究OCIL-rP2的生物学功能奠定了基础。     

Ficolin-A的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定

目的: 克隆小鼠ficolin-A(mouse ficolin-A)基因, 构建在真核及原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白, 并制备其抗体, 以进一步用于研究小鼠ficolin-A的功能.方法: 用RT-PCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolin-A cDNA片段, 并将该片段分别插入pVAX-1真核表达载体及pGEX-KG 原核表达载体中, 实现插入基因的融合, 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达.用GST-Sepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化, 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.制备ficolin-A的多克隆抗体并对其效价进行测定.结果: 成功地构建了pVAX-1-ficolin-A真核表达载体及pGEX-KG-ficolin-A原核表达载体, 并在大肠杆菌中获得高效的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致.并且成功制备了多克隆抗体.结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX-1-ficolin-A及pGEX-KG-ficolin-A, 并在E.coli BL21中表达了ficolin-A蛋白, 为下一步研究小鼠ficolin-A的功能奠定了基础.     

基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，并表达与纯化融合蛋白，制备其多克隆抗体。方法：通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段，Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到原核载体pGEX-4T-3，制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。鉴定后，在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化，重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。采用融合蛋白免疫家兔，制备其抗血清，测定抗血清效价和特异性。结果：经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功，表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000，免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。结论：实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，融合蛋白具备了较高的免疫反应性，并得到了其多克隆抗体，为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

小鼠PD-1胞外段的克隆、原核表达及活性分析

目的小鼠PD-1胞外段(ePD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆PD-1胞外段基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ePD-1,转化至E.coli DH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-ePD-1转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-ePD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的PD-1胞外段融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-ePD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-ePD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论成功地克隆、表达和纯化了小鼠ePD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴...     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

重组凝乳酶原基因的原核表达及其抗血清的制备

目的:原核细胞表达密码子优化的凝乳酶原并制备抗血清。方法:以大肠杆菌密码子的偏爱性整合牛、羊和骆驼的凝乳酶原(pCHY)序列后分别克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-30a和真核高效抗体制备核酸疫苗载体pcDNA3-AAT-COMP-C3d3(pcD-ACC)上。原核表达质粒pET30a-pCHY转入大肠杆菌后经IPTG的诱导得到高表达的凝乳酶原,作为检测抗原。真核表达质粒pcDNA3-AAT-COMP-pCHY-C3d3(pACCC)用水动力转染法验证其在mRNA水平的表达后,采用DNA prime-protein boost的策略免疫新西兰大白兔后制备抗体并检测其特异性和效价。结果:SDS-PAGE和Western blot检测表明,成功表达出与预期相对分子质量大小相符的重组凝乳酶原;ELISA检测表明获得高效价的凝乳酶原抗血清。结论:通过密码子优化及核酸疫苗载体pcD-ACC联合DNAprime-protein boost的免疫策略可制备高表达量的重组凝乳酶原,得到接近于蛋白免疫水平的高滴度抗体。     

HBV靶向核糖核酸酶真核表达载体的构建及其在2.2.15细胞内的表达

目的 构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（hEDN)与乙肝病毒核心蛋白（HBVc)的融合真核表达载体（该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶），抑制乙肝病毒在细胞内的复制。方法 分别从HL－60GGG细胞和2．2．15细胞中提取总RNA，用RT－PCR特异性扩增hEDN及HBVc编码基因，将hEDN和HBVc克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),hEND克隆入原核表达载体pGEX4T-1，并以纯化的原核表达产物免疫Balb/c小鼠，制备特异性抗体。用免疫荧光法检测pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN在转染2．2．15细胞内地表达。结果 成功地构建了hDNA和HBVc的真核融合表达载体。，并在2．2．15细胞中较高效地表达。结论 pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN的构建和在2．2．15细胞内的表达，为探索乙型肝炎的治疗开辟了新思路。     

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备

目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。