钙离子载体A23187诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(CI)A23187诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNCs)生成树突状细胞(DCs),探索DCs扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNCs,分别加入GM-CSF+IL-4,A23187。体外培养72 h后,于光镜、电镜下观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTT比色法检测其对同种异体T细胞的刺激增殖作用,ELISA法检测IL-12、IFN-γ的水平。结果:健康人PBMNCs在A23187的条件下培养72 h后,就可以看到典型的DCs形态,CD40、CD86、CD83分子的表达均明显增高,但CD1α分子的表达增高不明显。具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。IL-12、IFN-γ的水平比其他组明显增高。结论:健康人PBMNCs在钙离子载体A23187作用下能更有效地诱导生成成熟DCs。     

蛋白激酶C在A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞中的作用

目的 运用蛋白激酶C(PKC)特异性抑制剂Bis-1,初步探讨细胞内PKC信号途径在A23187诱导HL-60细胞向树突状细胞(dendritic cell,DC)分化过程中的作用,了解细胞内钙离子信号转导途径与PKC信号途径是否存在相互应答.方法 用PKC特异性抑制剂Bis-1预先处理HL-60细胞再用钙离子载体A23187处理,比较其与单用A23187处理的HL-60细胞在形态学、免疫表型及刺激T细胞增殖能力方面的差异.结果 单用A23187处理的HL-60细胞培养36 h后细胞出现树状突起,DC特异性标记CD83、CD80、CD86表达阳性率分别为(28.97±4.05)%、(19.10±5.46)%、(41.03±6.43)%;用PKC特异性抑制剂Bis-1预先处理再予A23187处理36h的HL-60细胞其形态、免疫表型及刺激T淋巴细胞增殖的能力均较单用A23187的HL-60细胞受到不同程度的抑制,细胞表面DC特异抗原CD83、CD80,CD86分子的阳性表达率分别降为(13.23±2.15)%、(9.70±1.69)%、(23.37±7.50)%,与单用A23187处理的HL-60细胞比较,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 PKC特异性抑制剂Bis-1在A23187诱导HL-60细胞分化为DC的过程中起抑制作用,表明PKC信号路径参与A23187诱导HL-60白血病细胞分化为DC的过程.     

钙离子载体联合GM．CSF体外诱导外周血单核细胞生成树突状细胞

目的：利用新型诱导剂钙离子载体A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞（PBMC）生成树突状细胞（DCs）。方法：采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,按不同培养方法分成：传统方法组,rhGM-CSF＋重组人白介素-4（rhIL-4）＋重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）;新型诱导剂组,加入rhGM—CSF4＋A23187。光镜观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DC细胞的表面标志,MTT比色法检测各组DCs刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力。结果：与传统方法相比,A23187联合rhGM—CSF诱导培养的DCs更具有典型的树突形态;DC表面分子CD83D1a、CD86、CIM0表达（45．2％、31．5％、40．1％、36．4％）较传统方法组（16．9％、20．4％、26．5％、22．3％）明显上调（P〈0．05）,而CD14表达（5．7％vs19．0％）明显下降（P〈0．05）,刺激同种异体T细胞增殖的能力更强。结论：新型诱导剂钙离子载体A23187联合GM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟的DCs。     

α-干扰素联合GM-CSF体外诱导培养脐血树突状细胞及其功能的测定

目的 探讨重组人α-干扰素(rhIFN-α)联合重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导培养脐血树突状细胞(DCs)的实验方法。方法 人脐血贴壁单个核细胞加入rhIFN-α及rhGM-CSF诱导培养,镜下观察培养细胞形态;流式细胞术检测培养细胞CD83、CD86的表达;MTT法检测诱导培养的DCs体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性。结果 人脐血贴壁单个核细胞经rhIFN-α联合rhGM-CSF共同培养后,第7d镜下可见有表面呈树状突起的DCs;细胞免疫表型检测结果示培养细胞有成熟DCs特异性标记CD83及共刺激分子CD86表达;rhIFN-α为600U／ml、rhGM-CSF为2000U／ml时为脐血DCs诱导培养的合适浓度(培养细胞CD83^ CD86^ 细胞比率最高);以诱导培养7d的脐血细胞(含DCs)作为刺激细胞与同种异体T淋巴细胞(反应细胞)以不同比例混合培养时,DCs均可刺激其增殖,其中以反应细胞：刺激细胞为20：1时最明显。结论 rhIFN-α联合rhGM-CSF细胞因子体外诱导人脐血贴壁单个核细胞,可生成具有典型形态及功能的成熟DCs。     

临床用的抗肿瘤树突状细胞疫苗的制备及保存

目的探讨在体外制备可供临床使用的肿瘤树突状细胞疫苗的有效途径及冻存方法.方法采用外周血单核细胞诱导DCs,自体胃癌细胞裂解抗原负载DCs,制备树突细胞疫苗.分别观察、检测了新鲜制备的DCs疫苗和冻存2周及2月的DCs疫苗的大体形态,免疫表型及刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力,并行细菌学检查.结果新鲜制备的DCs疫苗高表达成熟DCs表面标志物HLA-DR、CD80及CD83,具有很强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力.疫苗冻存2个月以内,DCs细胞表型及刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力无明显下降.结论采用本方法制备的DCs疫苗,无论从数量及质量均达到了临床应用的要求.并且证实疫苗冻存2月以内对疫苗质量无明显影响.     

A23187联合IFN-γ诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(calcium ionophore, CI)A23187 联合γ- 干扰素(IFN-γ) 诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNC) 生成树突状细胞(DC), 探索DC 扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNC, 分别加入GM-CSF +IL-4, A23187, A23187+IFN-γ。体外培养72 h 后, 分别于光镜、电镜下观察细胞的形态, 流式细胞仪检测细胞表面标志, M 比色法检测其对同种异体T 细胞的刺激增殖作用, ELISA 检测IL-12 和IFN-γ 的水平。结果:健康人PBMNC在A23187+IFN-γ 的条件下培养72 h 后, 与GM-CSF +IL-4 组, A23187 组比较, 能迅速获得典型的树突状细胞形态;CD40, CD83, CD86 分子的表达较均明显升高(P<0.01), 但CD1a 分子的表达明显下降(P<0.01);具有明显刺激同种异体T 细胞增殖的能力;IL-12, IFN-γ 的水平比其他组明显增高(P<0.01)。结论:A23187 联合IFN-γ 诱导健康人PBMNC 能更快速、有效地诱导生成成熟的DC。     

慢性乙型肝炎外周血树突状细胞的功能障碍机制的初步探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎者树突状细胞(DCs)的功能状态及机制。方法:以直接荧光法进行表型分析、CCK8法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激作用、AnnexinV/FITC法测定细胞凋亡率进行分析。结果:慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞经诱导分化形成的DCs,与正常人相比,表达协同刺激分子CD80、CD86水平均较低;刺激同种异体淋巴细胞增殖能力也低于正常人;DCs凋亡率明显增高。结论:慢性乙型肝炎患者外周血的DCs免疫功能处于抑制状态,而HBV感染导致的DCs凋亡增多可能是引起DCs功能障碍的原因之一。     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能影响的实验研究

目的探讨人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能的影响以及人骨髓间质干细胞发挥免疫抑制作用的可能机制。方法以Friedenstein法分离培养骨髓间质干细胞,以密度梯度离心法分离培养外周血单个核细胞,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素-4的培养条件下制备树突状细胞。在LPS(1ng/mL)诱导下获得成熟树突状细胞。将骨髓间质干细胞与成熟树突状细胞共培养48h后,混合淋巴细胞反应检测经骨髓间质干细胞处理前后树突状细胞对同种异体T细胞的增殖能力,流式细胞仪检测处理前后其表面共刺激分子CD86和成熟标记物抗原CD83的表达,ELISA法测定混合淋巴细胞反应上清中细胞因子的表达。结果与未成熟DCs组比较,成熟DCs组表面抗原CD86,CD83的表达均增加,对T淋巴细胞刺激能力增强,致炎细胞因子分泌(IL-12,IFN-γ)增多,而抑炎因子(IL-10)分泌减少,成熟DCs组经hMSCs处理后,表面抗原表达水平明显下降,致炎细胞因子分泌减少,而抑炎因子分泌增加,对T淋巴细胞刺激能力减弱,与未处理成熟组比较差异具有显著性,而与未成熟组比较差异无显著性。结论hMSCs能逆转成熟DCs为未成熟DCs状态,从能间接抑制DCs启动的T淋巴细胞增殖,抑制炎症因子的分泌,发挥免疫抑制作用。     

树突状细胞表面共刺激分子在哮喘小鼠中的作用研究

目的:研究哮喘小鼠骨髓来源树突状细胞(DCs)的表型及共刺激分子在哮喘发病中的影响.方法:用卵清蛋白建立哮喘模型,利用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导骨髓细胞分化为DCs,流式细胞仪检测DCs表面共刺激分子的表达,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激同种异体的T淋巴细胞增殖的能力.结果:在两种细胞因子的作用下,从骨髓中可以诱导出大量的DCs;且均表达DCs的表面标志(33D1).哮喘组DCs表达CD86分子的水平高于对照组,而CD40、CD80在两组之间没有差异;哮喘组与对照组DCs均能强烈刺激同种异体T淋巴细胞的增殖,哮喘组DCs的刺激能力明显强于对照组.结论:哮喘组DCs的抗原递呈能力增强,表明DCs在哮喘的发病中可能起着重要作用.     

外周血PBMC来源的树突状细胞的快速无血清培养方法及细胞信号转导机制

目的 探讨体外无血清条件下诱导人外周血单核细胞(PBMC)迅速生成树突状细胞(DC)的方法．并初步探讨钙离子载体(CI)诱导分化的信号转导途径与肿瘤坏死因子(TNF)-α所诱导的是否相同。方法 分离健康献血者的PBMC．给予无血清培养基及50ng／ml的rhGM-CSF过夜培养后，再分别给予100ng／ml的A23187或50ng／ml的TNF-α，或预先加入0．5μg／ml的环胞菌素A(CsA)30min后，再加入A23187、TNF-α，共培养40h。于相差显微镜下观察细胞形态的变化，流式细胞仪检测细胞的表面标志，MTT比色法检测不同方法处理的PBMC刺激同种异体T细胞的增殖作用。结果 健康献血者的PBMC在无血清条件下，给予rhGM-CSF及CI或TNF-α培养40h，均可获得DC的典型形态．包括CD14表达下调、CD83及共刺激分子(CD80、CD86)表达上调，以及较强刺激同种异体T细胞增殖的作用；上述由CI诱导的细胞形态的改变、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用均可被CsA所抑制。而TNF-α所诱导的细胞形态的改变、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用均不受CsA影响。结论 健康献血者的PBMCs在体外无血清条件下．司以被rhGM-CSF及CI或TNF-α迅速诱导成DC，但CI与TNF-α诱导PBMC分化为DC的细胞信号转导途径不同。     

外周血PBMC来源的树突状细胞的快速无血清培养方法及细胞信号转导机制

目的 探讨体外无血清条件下诱导人外周血单核细胞(PBMC)迅速生成树突状细胞(DC)的方法,并初步探讨钙离子载体(CI)诱导分化的信号转导途径与肿瘤坏死因子(TNF)-α所诱导的是否相同。方法 分离健康献血者的PBMC,给予无血清培养基及50 ng/ml的rhGM-CSF过夜培养后,再分别给予100 ng/ml的A23187或50 ng/ml的TNF-α,或预先加入0.5 μg/ml的环胞菌素A(CsA)30 min后,再加入A23187、TNF-α,共培养40 h。于相差显微镜下观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTT比色法检测不同方法处理的PBMC刺激同种异体T细胞的增殖作用。结果 健康献血者的PBMC在无血清条件下,给予rhGM-CSF及CI或TNF-α培养40 h,均可获得DC的典型形态,包括CD14表达下调、CD83及共刺激分子(CD80、CD86)表达上调,以及较强刺激同种异体T细胞增殖的作用;上述由CI诱导的细胞形态的改变、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用均可被CsA所抑制。而TNF-α所诱导的细胞形态的改变、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用均不受CsA影响。结论 健康献血者的PBMCs在体外无血清条件下,可以被rhGM-CSF及CI或TNF-α迅速诱导成DC,但CI与TNF-α诱导PBMC分化为DC的细胞信号转导途径不同。     

多西环素对树突状细胞功能的影响

目的探讨多西环素对树突状细胞的免疫表型和功能的影响。方法采集健康人的外周血,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞,用rhIL-4和rhGM—CSF诱导分化为树突状细胞,通过LPS诱导树突状细胞成熟。树突状细胞诱导成熟过程中向培养基中分别加入0μg／mL、100μg／mL和300μg／mL的多西环素,通过流式细胞术检测树突状细胞表面HLA—DR、CD83和CD80的表达,用ELISA检测树突状细胞分泌TNF—α、IL-6、IL-12和IL-10,与T细胞共培养检测刺激同种异型T细胞的增值能力。结果与对照组相比,100ng／mL和300ng／mL多西环素处理组诱导树突状细胞表达HLA—DR表达下调。多西环素可下调树突状细胞分泌IL-1B、IL-12、TNF-α和IL-6,也可抑制树突状细胞刺激同种异型T细胞增殖,并呈剂量依赖性。结论多西环素作用于树突状细胞成熟过程,导致树突状细胞下调HLA-DR的表达,抑制树突状细胞分泌IL-1B、IL-6、IL-12和TNF—α,下调其刺激同种异型T细胞的增值能力。     

HL-60细胞凋亡小体体外负载树突状细胞的实验研究

目的 :证实树突状细胞 (Dendritic cells,DCs)可通过吞噬凋亡小体获取抗原物质 ,探讨其在肿瘤免疫治疗中的意义。方法 :利用吸附单克隆抗体 -磁珠分离系统 (MACS) ,从人脐血中分离出 CD34+ 细胞 ,体外以重组 h GM- CSF+ h SCF+ h TNF-α+ h FL诱导培养 DCs,光镜观察诱生细胞的形态 ,流式细胞术 (FACS)检测其表型。电镜观察和流式细胞仪检测三氧化二砷 (As2 O3 )诱导凋亡的 HL - 6 0细胞 ,将凋亡的 HL- 6 0细胞与培养早期的 DCs共育 4～ 8h,电镜观察 DCs吞噬凋亡小体的现象。结果 :CD34+细胞经诱生后生成了大量具有典型形态和表型的成熟 DCs;电镜下见凋亡的 HL- 6 0细胞内凋亡小体形成 ,流式细胞仪检测 DNA含量 ,见亚二倍体峰形成。凋亡细胞与 DCs共育后 ,电镜下见 DCs吞噬凋亡小体的现象。结论 :DCs可通过吞噬凋亡小体摄取抗原物质。     

Role of myeloid differentiation factor 88 in HSP60 signal transduction in dendritic cells

Objective: To explore the role and mechanism of myeloid differentiation factor88 (MyD88) in HSP60 signal transduction in dendritic cells. Methods:Mouse DCs were cultured from murine bone marrow cells. The DC marker CD11c was detected by flow cytometry, then DCs were divided into control group, HSP60 groupand RNA interference group. Control group was cultured under normal condition, and HSP60 group was cultured with 10 μg/ml of HSP60. RNA interference group was first cultured with MyD88 siRNA forl2 hours and then HSP60 was added into the culture mixture. All groups were cultured for 48 hours. Immunochemistry was used to detect the concentration of MyD88 and NF- κB. Western blot was used to detect the concentration of MyD88. Flow cytometry and mixed lymphocyte reaction (MLR) were used to detect the phenotype and functional properties of DCs. ELISA was used to detect the concentration of TNF-α, IFN-γ and IL-12 in the supernatant. Results:The expression of CD11c in marine bone marrow DCs was 88.76%. HSP60 stimulation increased the expression of CD80, CD86, MHC-Ⅱ in DCs and TNF-α, IFN-γ, IL-12 secretion in the supematant. HSP60 stimulation also increased the level of MyD88 in the cytoplasm and promoted the shift of NF-κB to karyon and the proliferation of allogeneic T cells. MyD88 siRNA could decreaseMyD88 and inhibit these effects induced by HSP60. Conclusion:HSP60 activates DCs through MyD88-dependent pathway. MyD88 plays a critical role in HSP60 signal transduction. Inhibition of MyD88 may be a novel way for treating disease correlated with HSP60.     

MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86及对混合淋巴细胞反应的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及其对混合淋巴细胞反应的作用。方法流式细胞仪检测MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析CD80和CD86mRNA表达情况;75Gy照射MG132诱导的HL-60细胞后,用CCK-8检测提高共刺激分子表达后,HL-60细胞对健康人单个核细胞的增殖作用。结果MG132上调HL-60细胞表达CD86,高浓度的MG132对HL-60细胞有直接杀灭作用,MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86后,对健康人单个核细胞起增殖作用。结论MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86,促进对健康人单个核细胞的增殖作用。