Wnt信号通路在创伤微环境诱导的表皮细胞去分化过程中的作用

目的 研究创伤微环境对表皮细胞的去分化诱导作用,并探讨Wnt通路在这一过程中的作用. 方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞.处理后的表皮片经免疫组化鉴定后移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5 d后用免疫组化法检测皮片内细胞的表型特征,RT-PCR和Western blot检测表皮细胞表型转化过程中Wnts分子及下游分子的表达变化. 结果 未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性.而去基底皮片移植后5 d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞.同时在移植皮片内Wnt-10b、Wnt-4和Wnt-7a mRNA的表达分别增加了3.1倍、2.2倍和1.4倍,而Wnt通路下游β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达分别增加了3倍、1.5倍和2倍(P<0.01). 结论 创伤微环境可诱导表皮细胞去分化,Wnt/β-catenin信号通路可能在这一过程中起关键性的调控作用.     

去分化来源表皮干细胞的分离、培养和鉴定

目的 分离培养去分化来源的表皮十细胞(dedifferentiation-derived epidermal stem cells,DDESCs),并进一步观察其表型特征.方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮十细胞后,移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,移植5 d后收集皮片制备单细胞悬液,流式检测CK10、CK19和β1整合素阳性细胞白分数,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内DDESCs,并采用免疫荧光法和荧光定量PCR法分别检测去分化细胞内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达.结果 流式检测结果表明,皮片移植5 d后,CK10阳性细胞减少(P＜0.01),CK19和β1整合素阳性细胞增加(P＜0.01).Ⅳ型胶原粘贴分离DDESCs,结果表明,移植皮片组在10 min内约有4.56%的贴壁细胞出现.细胞的表型分析结果表明,DDESCs内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达量类似于原始表皮干细胞(P＞0.05),但明显高于成熟表皮细胞(P＜0.01).结论 DDESCs的表型特征与原始表皮干细胞相类似,提示去分化细胞有可能代替原始表皮干细胞应用于创伤部位的修复和再生.     

烧伤后皮肤混合移植中局部免疫抑制的研究

目的 探讨混合皮肤移植的免疫学机制。方法 建立烧伤大鼠混合皮肤移植的动物模型及模拟混合皮肤移植的烧伤患者淋巴细胞，异体表皮细胞，自体表皮细胞的混合培养体系。进行大体和病理观察，淋巴细胞的增殖反应，细胞免疫和体液免疫指标的检测。结果 （１）组织学检查显示，异体移植于术后１４－２１天遭排斥，混合移植处未见明显排异反应。（２）体外模拟混合移植实验中，自体淋巴细胞对异体表皮细胞的免疫庆答强度明显减弱。（３     

鼠异体无细胞真皮基质（ADM）的制备和应用

目的：通过动物实验方法,探讨一种适合薄的自体断层皮片或培养表皮细胞膜片生长的真皮床,使两者结合成为复合皮,以期为临床应用。方法：将异体鼠的全厚皮切制成厚０．３ｍｍ的中厚皮征,先后经１Ｍ ＮａＣｌ溶液去表皮、０．１％戊二醛交联、０．５％ＳＤＳ脱真皮细胞、０．２５％胰蛋白酶再消化及冷冻干燥处理,清除皮肤中具有抗原性的所有细胞成分,而较完整地保留了无免疫源性的细胞外基质蛋白和胶原,制得无细胞真皮基质（ＡＤＭ）。与薄的自体断层皮片（厚０．１ｍｍ）一起制成复合皮移植于创面上。结果：术后２周见复合皮成活率高。组织学检查证实ＡＤＭ血管化良好,宿主细胞如成纤维细胞可长入ＡＤＭ中。长期观察证实无明显瘢痕形成及挛缩畸形,后期收缩轻;表面平滑,质地柔软,有弹性,无水疱形成及排异反应。结论：目前认为,表皮－真皮复合皮是一种较为理想的真     

含表皮细胞的无细胞真皮复合皮的构建及生长活性研究

为探讨体外构建复合皮的可能性，制备来源于猪皮的无细胞真皮基质，在其表皮面种植表皮细胞于体外培养，定期消化分离无细菌真皮上的表皮细胞，采用细胞计数法和增殖试验观察表皮细胞增殖活力，并分别于1周和2周后通过组织切片HE染色、扫描电镜观察细胞生长状况。结果显示，表皮细胞随培养时间延长，数量明显增多，且仍具有一定的增殖潜力。培养1周、2周后分别形成单层细胞膜片及含3－6层细胞的复层膜片。提示以异种无细菌真皮为载体，可于体外成功构建含表皮细胞层的活性复合皮。     

表皮细胞培养最佳条件的探索

目的：研究表皮细胞培养的最佳条件,为进一步将其作为皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法：以DMEM作为基础培养液,改变培养条件后,计数2周内克隆形成数,检测细胞增殖能力,确定最佳条件。结果：表皮细胞以分离酶分离可得到大多数基底细胞,在培养液pH值为7．0－7．2,钙离子浓度为0．4mmol/L,血清浓度为18％,温度为36℃,CO2浓度为6％时,表皮细胞克隆形成数量高。结论：在最佳培养条件下,表皮细胞生长状态良好,为人工表皮的构建奠定了基础。     

自体表皮细胞培养与异体真皮组合应用研究

严重烧伤病人皮肤修复中主要未解决的问题是真皮的替代。动物实验结果表明，异体皮移植后５天，用自体培养表皮细胞膜片覆盖真皮床，１４天后复合皮成活率是８４．６％±２．４％。组织学检查证实表皮已形成了复层结构，可见基底层、颗粒层和角质层。临床应用中，异体皮移植后１０天，去除异体表皮覆盖病人的自体培养表皮，３５天后未见排斥征象，异体真皮促进了培养表皮的分层、成熟和完整，组织学检查证实表皮细胞的边缘清楚，已分化形成颗粒层和角质层，真皮多细胞，已血管化，但表皮嵴缺乏。     

良性骨病变的侵袭征象——MRI,CT,X线平片对比研究

目的 探讨良性骨病变在影像学上出现的侵袭性征象及其对诊断的影响.方法 回顾影像学上有侵袭性征象并经手术病理或临床随访证实的良性骨病变患者资料200例,所有病例均行X线平片检查,其中177例行CT平扫,103例行MRI平扫,三种检查方法齐全者89例.统计侵袭性征象,主要包括周围骨髓与软组织水肿,有占位效应的异常软组织影,不连续的骨膜反应,骨皮质的中断与病理性骨折,类似瘤骨的软组织内钙化骨化或残余骨质.计算三种影像学方法对各病例的诊断与病理的符合率,并做统计学分析.结果 出现骨髓及周围软组织水肿的病例中,骨母细胞瘤9例,软骨母细胞瘤6例,骨样骨瘤9例,Langerhans细胞组织细胞增生症17例,疲劳骨折18例,骨结核25例,不典型骨髓炎7例.出现异常软组织影的病例中,骨母细胞瘤7例,软骨母细胞瘤1例,Langerhans细胞组织细胞增生症15例,骨结核17例.出现不连续骨膜反应的病例中,其中骨样骨瘤1例,Langer-hans细胞组织细胞增生症3例,疲劳骨折3例,骨结核1例,不典型骨髓炎3例.出现骨皮质的中断及病理骨折的病例中,骨母细胞瘤7例,软骨母细胞瘤3例,骨样骨瘤4例,Langerhans细胞组织细胞增生症26例,疲劳骨折14例,骨结核28例,不典型骨髓炎4例.出现类似瘤骨的软组织内钙化骨化或残余骨质的病例中,骨母细胞瘤1例,软骨母细胞瘤2例,Langerhans细胞组织细胞增生症2例,骨结核5例.对于良恶性符合率及病理符合率,CT均略高于MRI(P ＜0.05),三种影像学方法的综合应用,可以明显提高诊断符合率(P＜0.05).结论 许多良性骨病变可伴发侵袭性征象,给诊断带来困难.联合应用三种影像学方法综合判断,是避免误诊为恶性肿瘤的最简单可行的办法.     

人工表皮构建及其结构的研究

目的 :以角朊细胞作为种子细胞 ,构建人工表皮 ,检测培养的人工表皮的结构 ,为进一步进行动物移植试验奠定基础。方法 :(1)采用分散酶 (dispase)分离表皮细胞 ,以无血清培养法培养表皮细胞。 (2 )人工表皮构建成功后 ,分别进行HE染色及透射电镜观察。 (3)角蛋白免疫组织化学染色。结果 :经过 2～ 3周的培养 ,表皮细胞连接成片 ,呈现典型的“铺路石”状 ;继续培养 5～ 7d后 ,将细胞膜消化下来 ,HE染色显示由 2～ 4层细胞组成 ,电镜可以观察到桥粒及张力微丝束的结构 ;免疫组织化学染色显示培养细胞和细胞膜角蛋白染色阳性。结论 :该人工构建表皮与人正常表皮结构类似 ,可作为移植物进行深入研究     

大鼠烫伤创面愈合过程中皮肤基底膜层黏连蛋白的变化

目的：研究烫伤愈合过程中层黏连蛋白(LN)的表达。方法：采用免疫组化方法在大鼠浅Ⅱ度烫伤（伤后1,3,5,7,10,14d组）、Ⅲ度烫伤切痂混合移植模型（大张异体皮移植3,5,7,14,21,28d组）上研究了愈合过程中LN的变化。结果：正常皮肤基底膜中含有LN，而创伤后表皮细胞迁移缘LN消失，愈合后表皮下LN又出现。混合移植后7d出现异体皮排异反应，表现为异体表皮细胞铲除，而异体表皮下仍可见LN阳性表达。异体皮移植后10d，从自体皮迁移来的表皮细胞下有零星LN，而异体表皮细胞被完全铲除，异体皮基底膜处LN仍基本保持完整。异体皮移植后21d，自体表皮已基本覆盖异体皮区，此时LN表达已基本完整。结论：烫伤愈合过程中LN的变化有助于创面愈合。