微流控芯片及其在病原体检测中的应用

微流控芯片又称芯片实验室,是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的技术平台。微型化、集成化的微流控芯片具有高效、快速、样品和试剂用量少、节约药品等优点,促进了其在病原体检测中的应用。本文对微流控芯片在病原体检测中的优势及其应用研究进展进行综述。     

微流控芯片技术在心血管疾病研究中的应用

心血管疾病是威胁人类健康的重要疾病，具有很高的致死率和致残率，已成为现代医学研究的热点话题。将传统实验技术用于心血管疾病发生机制、诊断及治疗等方面的研究具有一定局限性。微流控芯片技术是一项新型实验研究手段，具有微型化、集成化、高通量、低消耗、高灵敏、分析速度快等特点，其在体外生物模型构建、生物分子检测、药物疗效评价及筛选等方面较传统技术具有优势，现已逐渐应用于医学生物学研究的多个领域。本文谨对微流控芯片技术在心血管疾病研究领域的应用进行简要综述。     

心肌损伤标志物即时检测技术的应用进展

快速检测心肌损伤标志物可以为急性心肌梗死诊断提供重要依据。该文主要对纸基类检测、生物传感器、微流控芯片技术和可穿戴设备等即时检测技术在检测心肌损伤标志物中的应用作一介绍。     

基于微流控核酸等温扩增的 登革病毒现场快速检测技术研究

[摘要]?目的?结合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和微流控芯片技术，建立一种适合现场快速检测登革病毒的方法。方法?利用RT-LAMP，针对登革病毒基因组中3’非编码区中特异性序列进行扩增，建立基于微流控芯片技术的LAMP检测方法，优化检测体系，并对该方法的灵敏性和特异性进行评估。结果?基于LAMP 和微流控芯片技术的登革病毒检测方法，通过对病毒模板进行扩增，发现与其他病毒无交叉反应，特异性良好；同时，结果显示该方法对登革病毒检测灵敏性可达61.2 pg/μl，与实时荧光定量PCR仪所达到的检测灵敏性一致。结论?基于LAMP和微流控芯片技术的登革病毒检测方法具有操作简单、快速、对设备要求低等优势,并且灵敏性、特异性均较好，是一种便于开展现场快速检测的方法。     

浙江温州地区1020例乙型肝炎患者HBV基因分型研究

目的:了解浙江温州地区乙肝病毒基因型分布,初步评价微流芯片分析仪在乙肝病毒基因分型中的应用特点.方法:用HBV基因型特异引物经聚合酶链反应扩增温州地区1 020例慢性乙型肝炎患者血清HBV,其扩增产物应用微流芯片检测.结果:该地区1 020例患者中966例有基因分型结果,其中B型20.49%(198/966)、C型66.46%(642/966),B、C混合型4.87%(47/966),C、B混合型6.21%(60/966),D型1.97%(19/966).结论:浙江温州地区乙型肝炎病毒基因型分布具有北方流行特点,微流芯片在同类检测方法中具有灵敏、准确、快速优势.     

微流控芯片与基因诊断关系的研究进展

<正>微流控芯片(MC)也称为芯片实验室,其已经广泛于医学、生物、电子、流体、化学等领域~([1,2]),且MC可把样品制备、反应、分离、检测、扩增、分析等集成到一块几微米至几百微米尺度的芯片上并自动完成所有基本过程。目前,MC已经广泛地应用到医学基因诊断(GD)方面,例如基因多态性检测~([3])、基因高效性测序~([4])、基因快速性扩增~([5,6])等,为此,本文主要对MC与GD关系进行综述。1 MC简介1.1 MC相关概念MC主要是指在几微米至     

基于微流控平台的胶质母细胞瘤干细胞中miRNA-874表达的研究

目的通过微流控检测平台,研究miRNA-874（miR-874）表达在胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）生长中的作用及意义。 方法应用高通量、多样本、低成本的微流控技术,对GSCs和神经干细胞（NSCs）进行miR-874转染,并通过荧光定量PCR检测细胞内miR-874和mRNA表达等一系列细胞分子生物实验,研究miRNA-874对GSCs生长和凋亡的作用。 结果miR-874在GSCs中的表达显著降低,约为NSCs中表达量的2%~40%（P<0.05）。利用树状分子将miR-874转染入GSCs中后,GSCs的细胞数量显著下降,凋亡细胞的数量显著上升,提示miR-874对GSCs具有杀伤作用。 结论miR-874在GSCs中表达显著降低,在GSCs中过表达miR-874会导致显著的细胞生长抑制和死亡,有助于开发基于miRNA的新型脑癌药物和疗法。     

环介导等温扩增技术检测方法的研究进展

环介导等温扩增技术是一种可用于临床诊断的快速检测方法,可用于检测病毒、细菌、寄生虫等多种病原体。经不断完善,现已在临床检测过程中发挥重要作用。可用显色试剂对反应结果实现可视化,即结果的即时显示,无需后续验证。但是,无论是荧光染料还是显色指示剂,对反应过程都会产生或多或少的影响,目前研究表明羟基萘酚蓝是最好的显色试剂。同时,人们发现电化学技术也可以应用于此,使检测反应更快,操作更加简单。生物传感器可以对多种反应产物进行同步检测,而微流控芯片技术更是方便携带,有望成为实时检测技术的理想载体。     

腺相关病毒Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的体外研究

目的 研究腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)Rep78蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用及机制.方法 将土拨鼠肝炎病毒(WHV)全基因组DNA从质粒中酶切回收,线状DNA重新连接呈环状.用脂质体Fugene 6体外转染至HepG2细胞,同时共同转染含有Rep78的质粒AAVdl52-91.5 d后收获细胞DNA,Southern blot检测WHV DNA复制.以含有HBV全长的质粒为模板,PCR法分别扩增出HBV-S、C和X基因全长.以凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测Rep78与HBV-S、C和X的结合.结果 Southern blot结果表明,AAV-Rep78可以明显抑制WHV病毒在HepG2细胞中的复制,并呈剂量依赖关系.EMSA结果显示,Rep78蛋白在体外能够与HBV-S、C和X的DNA结合,其中与HBV-C的结合最强而且有剂量依赖关系.此外,这种Rep78蛋白与HBV-C DNA结合可以被特异性的Rep78抗体阻滞,形成超结合带.结论 AAV-Rep78可以抑制HBV DNA的复制,其机制可能在于Rep78蛋白结合并抑制了HBV-C基因.     

食管癌仿生类器官模型的构建研究

目的 构建食管癌类器官来源的仿生单层中空复合水凝胶微纤维类器官芯片。方法 基于微流控技术制备生物复合水凝胶,通过体外共培养,建立一种可负载食管癌类器官来源单细胞悬液的新型3D单层中空食管仿生类器官。结果 中空微纤维具有完整的中空结构,内层为食管癌细胞,外层为血管内皮细胞,且食管癌细胞的生长与常规液体培养条件下差异无统计学意义(P>0.05)。结论 本研究制备的食管癌仿生类器官模型可较好地还原食管癌的病理结构,具有良好的生物相容性,为食管癌发病机制、疗效检测及个体化精准治疗研究等奠定了基础。     

利用RNA干扰技术抑制糖调节蛋白78在大肠癌细胞系中的表达

目的:观察靶向shRNA质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78)对大肠癌PKO细胞系GRP78mRNA汲蛋白的作用.方法:采用免疫组织化学及半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测结直肠腺癌、腺瘤及正常黏膜组织,PGRP7865表达:使用脂质体2000将GRP78靶向shRNA质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78)转染至RKO细胞内,应用RT-PCR与Western blot法检测GRP78基因及蛋白的表达.结果:GRP78在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常黏膜组织(9.470±0.754 vs 0.780±2.468,Z=-8.140,P<0.05),腺瘤组织中其表达水平高于正常黏膜组织而低于癌组织,差别有统计学意义(5.330±2.744 vs 1.000±0.840,9.560±2.093,均P<0.05).然而在mRAN水平上,GRP78在3种组织中的表达无统计学意义:靶向shRNA质粒表达载体PGPU6/GFP/NeoGRP78能明显抑制RKO细胞中GRP78蛋白及mRNA的表达(F=11.670,27 1.860,均P<0.05).结论:靶向shRNA质粒表达栽体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78)能明显抑制RKO细胞GRP78mRNA及蛋白的表达,为进一步明确GRP78在结直肠腺癌细胞增殖动力学中的作用奠定了实验基础.     

高灵敏度薄膜生物传感器基因芯片系统的研制

目的: 在传统基因芯片技术基础上, 应用生物传感器技术, 研制一种能将基因芯片信号原位放大后达肉眼判读灵敏度, 无需专用基因芯片检测仪器就可使用, 易于在基层医疗单位推广的薄膜生物传感器基因芯片诊断系统.方法:在薄膜生物传感器基片基础上, 经过表面化学处理, 使特定的基因捕获探针在传感器表面固定, 形成特定检测目的生物传感器基因芯片. 并以乙肝病毒YMDD区的特异序列设计为例, 通过特定的YMDD区的捕获探针, 以矩阵的形式点样于传感器芯片表面来实现本系统. 同时, 纳米金标记的检测探针取代了传统芯片中的荧光标记探针. 扩增后的目的PCR片段与捕获探针、生物素标记探针、链亲蛋白纳米金探针进行反应, 最后得到探针-生物素-链亲蛋白-纳米金复合物, 并在芯片表面经生物传感器芯片将信号原位放大, 获得肉眼观的芯片信号并进行分析, 完成芯片诊断. 以乙型肝炎病毒YMDD突变为例, 观察该芯片系统对临床诊断标本诊断的可靠性.结果: 基因芯片的检测信号经生物传感器原位放大后能肉眼判读或借助普通数码照像机或计算机扫描, 根据信号出现的特定位置即可确定突变的类型. 且该生物传感器基因芯片系统信噪比高, 在人工合成的寡核苷酸及临床血清的检测中, 均可实现生物芯片阴阳性信号完全的有或无的判读; 临床血清标本检测证实, 使用该传感器芯片系统对前期经过测序确定为YMDD突变的23份临床血清结果与测序结果完全一致. 结论:薄膜生物传感器基因芯片集纳米材料、生物传感器技术及原位放大技术为一体, 实现了信号的肉眼判读, 具有通用性高, 准确可靠, 无需大型设备, 易于在基层医疗单位推广使用.     

液体芯片飞行时间质谱技术在肿瘤临床研究中的应用

液体芯片飞行时间质谱技术(ClinProt系统)是近年开发的蛋白质组学新技术,其利用纳米磁珠俘获肿瘤患者与对照者体液中低丰度或低相对分子质量特异蛋白/多肽.经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定和软件分析,建立由两者差异表达蛋白/多肽组成的质谱图模型,用于预测未知样品的归属.该系统具有良好的特异性、灵敏性和重复性.高通量,操作简单、快捷等优点,能对所获得的差异蛋白/多肽进行蛋白鉴定,是极具潜力的临床肿瘤早期诊断工具.本文将就目前ClinProt系统在临床肿瘤研究中的应用进行综述.     

PTEN和VEGF在肺癌中的表达及意义

目的研究PTEN和血管内皮生长因子（VEGF）在肺癌中的表达、临床意义及其相关性.方法应用组织微阵列仪制作肺癌组织芯片.用免疫组织化学S-P法检测PTEN、VEGF在76例肺癌和30例正常肺组织中的表达.结果肺癌组织中PTEN蛋白阳性表达率显著低于正常肺组织（P＜0.01）,VEGF蛋白阳性表达率显著高于正常肺组织（P＜0.01）;PTEN、VEGF的表达与组织分化程度、淋巴结转移和临床病理分期有关;两者表达呈负相关（P＜0.01）.结论联合检测PTEN、VEGF对肺癌的恶性程度及预后判断具有重要的临床意义,应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本具有快速、准确、方便经济的特点.     

大鼠脑缺血后内质网伴侣蛋白GRP78和GRP94及胱冬酶12表达的改变

目的观察大鼠局灶性脑缺血时内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白（glucose-regulatedprotein GRP）78、GRP94及内质网凋亡因子胱冬酶（easpase）12的变化,探讨内质网分子伴侣及凋亡因子在脑缺血损伤中的作用.方法Wistar大鼠60只,雌雄各半,随机分为假手术组和缺血组,各为30只.采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血模型.应用免疫组织化学及半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测缺血6、12、24h大鼠纹状体GRP78、GRP94及caspase-12 mRNA表达变化.结果免疫组织化学和RT-PCR检测均发现缺血组GRP78、GRP94 mRNA表达低于假手术组（P＜0.05）;其mRNA及蛋白表达在缺血12 h达峰值,与6、24 h比较差异有显著性（P＜0.05）.缺血组缺血6h caspase-12表达升高,12 h达高峰,24h明显下降;假手术组未见caspase-12表达.结论大鼠纹状体缺血后可能通过GRP78、GRP94表达升高启动内质网自稳调节系统;严重的脑损伤GRP78、GRP94表达下降.内质网caspase-12凋亡通路的启动可能是脑缺血损伤的又一机制.     

p63、Bcl-2和PCNA蛋白在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义

目的 探讨p63、Bcl-2和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白在B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)发生、发展中的作用.方法 应用免疫组化染色法检测p63、Bcl-2及PCNA蛋白在50份B-NHL组织和20份反应性增生淋巴组织中的表达,分析各指标间及与B-NHL临床病理参数的关系.结果 p63、Bcl-2和PCNA蛋白在B-NHL组织中阳性表达率分别为60％、78％和80％,在反应性增生淋巴组织中的阳性表达率分别为5％、35％和35％,两两比较P均＜0.05；p63与Bcl-2、PCNA蛋白表达均呈正相关,r=0.453、0.800(P＜0.001或0.01)；三指标与患者年龄、B-NHL病理类型等临床病理参数均无明显关系(P均＞0.05).结论 p63可能与Bcl-2、PCNA协同参与B-NHL的发生,具体机制尚需进一步研究.     

蛋白质芯片在鼠疫患者血清抗体谱检测中的应用

目的检测鼠疫患者血清抗体谱,为鼠疫的疫苗研究奠定基础。方法利用鼠疫耶尔森氏菌毒流力相关蛋白的蛋白质芯片检测鼠疫患者血清抗体谱。结果利用一个包含145个鼠疫菌毒力相关蛋白的蛋白质芯片,在鼠疫患者血清中检测到37种鼠疫菌蛋白相应的抗体。结论通过对鼠疫患者血清抗体谱的分析,寻找到新的能在人体内产生体液免疫的蛋白。     

HBV pre-X转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的:检测HBV Pre-X在真核表达栽体PcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X转染的HepG2细胞中的表达,并筛选其中的代谢相关差异表达基因.方法:将构建的真核表达载体pcDNA3.1-mychis-HBV pre-X转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:将pcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X和pcDNA3.1-myc-his载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA后逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因.结果:构建的真核表达载体经ApsI、BstXI双酶切鉴定,转染HepG2细胞后HBV pre-X表达经蛋白免疫印迹证实:经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是200个和62个.结论:筛选HBV pre-X转染HepG2细胞后的代谢相关差异表达基因,从而为乙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据.     

寡核苷酸芯片技术在甲型流感及登革病毒检测分型中的初步应用

目的 建立寡核苷酸芯片检测技术,对甲型流感病毒及登革病毒进行早期检测及分型.方法 根据Genebank中病毒基因组序列的保守区域,设计病毒的特异性检测探针,制备病毒检测芯片;利用限制性显示技术标记样品中的病毒靶序列,将标记产物与芯片杂交、清洗、扫描及结果分析.结果 该方法可以正确检测到细胞培养所获得的甲型(H1N1,H3N2)流感病毒和登革四型病毒.结论 寡核苷酸芯片技术可应用于多种病毒及其亚型的早期检测.     

老年非小细胞肺癌患者GRP94及GRP78蛋白表达及其临床意义

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)中细胞应激因子GRP94及GRP78蛋白表达及其与临床分期及生存期的关系。方法选取该院接受外科手术切除治疗的64例NSCLC患者,应用电话随访的方式了解患者的术后情况和生存期;使用免疫组化技术检测研究对象的病理切片标本中GRP78和GRP94的表达水平。结果 GRP94与GRP78蛋白在NSCLC肿瘤细胞中明显高表达状态;GRP94、GRP78蛋白的表达与NSCLC病理类型有关,与分化程度、肿瘤T分期、肿瘤N分期、WHO临床分期具有不同程度的联系,也与肿瘤的大小、浸润、转移有关;与性别和年龄无关。GRP94及GRP78蛋白的高表达与NSCLC患者生存期及生存率呈明显负相关,其蛋白表达水平越高,患者的生存期越短,生存率越低。结论 GRP78和GRP94是NSCLC发生、发展中的重要因子,可作为肿瘤分期和预测预后的一项指标。