NIR结合LS‒SVM用于六神曲发酵过程质量监测的适用性研究

目的:考察近红外光谱分析(NIR)技术结合最小二乘支持向量机(LS-SVM)用于六神曲发酵过程质量监测的适用性。方法:利用近红外光谱仪获取67个发酵过程六神曲样品在400-2 500 nm范围内的光谱数据,并用Folin-酚法与DNS法分别测定了六神曲样品的蛋白酶与淀粉酶活力,运用LS-SVM建立蛋白酶与淀粉酶活力的预测模型。结果:蛋白酶近红外模型的Rc与Rp值分别为0.975,0.938;RMSEC与RMSEP分别为5.297,9.795;淀粉酶近红外模型的Rc与Rp值分别为0.987,0.973;RMSEC与RMSEP分别为7.215,6.864。结论:此模型可用于六神曲发酵过程中蛋白酶与淀粉酶活力的定量分析,为六神曲发酵过程质量参数的在线检测奠定了基础。     

六神曲最佳发酵周期研究

目的:探讨不同发酵时间六神曲中淀粉酶、糖化酶、蛋白酶活力的动态变化规律,验证六神曲样品对小鼠肠胃运动的影响,为六神曲最佳发酵周期的确定提供依据。方法:取8批六神曲每天发酵样品,分别测定其中淀粉酶、糖化酶、蛋白酶的活力,选择最佳发酵天数。此后选取最佳天数的六神曲进行药效学验证。结果:淀粉酶、糖化酶活力在第4天达到峰值,蛋白酶活力到第5天达到峰值,以第4天样品进行药效学研究发现其对小鼠肠胃运动有显著影响,同时能显著升高食积模型小鼠的胃泌素、胆碱酯酶含量,降低血清NO含量。结论:六神曲发酵第4天,综合酶活力较高,且经验证有较好的消食作用,因此其最佳发酵时间为第4天左右。     

六神曲固态协同发酵工艺优化及物质动态变化研究

目的:优化六神曲固态协同发酵工艺并研究发酵过程中物质动态变化。方法:以枯草芽孢杆菌与赛氏曲霉为发酵菌种,蛋白酶和淀粉酶活力为指标,通过单因素实验确定最佳接种比例与发酵时间,采用正交试验优选发酵温度、湿度及接种量。采用HPLC测定六神曲发酵前后苦杏仁苷及青蒿素含量变化,另对发酵过程中两种菌株数量变化与酶活进行检测。结果:最佳发酵工艺为赛氏曲霉和枯草芽孢杆菌接种比例1∶2,时间8 d,温度30℃,湿度85%,接种量10%,蛋白酶与淀粉酶活力分别达到2.16 mg·min~(-1)·g~(-1)和74.84 mg·min~(-1)·g~(-1);苦杏仁苷在发酵后被分解代谢,青蒿素在协同发酵中被代谢但在自然发酵过程中含量基本不变,并且发现两种菌株数量变化与酶活有明显的相关关系。结论:协同发酵工艺条件稳定可行,为六神曲发酵工艺的规范化奠定基础。苦杏仁苷与青蒿素含量均不适合作为质量评价指标。     

六神曲中真菌的分离与鉴定

目的：对传统工艺发酵六神曲中真菌进行分离与鉴定研究。方法：采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵六神曲分离真菌,使用生物显微镜进行显微形态学鉴定,DNA测序进行分子生物学鉴定。结果：从传统发酵六神曲分离并确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌,青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌。黄曲霉菌和产黄青霉菌发酵六神曲气味纯香,表面遍布白衣略有黄衣出现与传统发酵相似;枝孢霉菌发酵六神曲产生霉腐气味,曲块表面暗灰褐色与传统发酵差别大,推测枝孢霉菌为六神曲发酵中产生的杂菌。结论：从传统方法发酵的六神曲分离得到3株真菌,经形态学鉴定及分子生物学鉴定,确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌,青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌,为六神曲有效菌群的筛选提供了重要的物质基础研究。     

Box-Behnken响应面法优化六神曲两优势菌协同发酵工艺

目的 利用Box-Behnken响应面法优化六神曲中2种优势菌的协同发酵工艺。方法 利用米根霉Rhizopus oryzae、扣囊复膜孢酵母Saccharomycopsis fibuligera 2种优势菌协同六神曲发酵,在《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第19册中六神曲组方的基础上,以蛋白酶活力和淀粉酶活力为评价指标进行发酵工艺单因素考察,进而采用Box-Behnken响应面法设计四因素三水平试验,并结合CRITIC权重法计算2种酶活力的综合得分,优化筛选六神曲2种优势菌协同发酵工艺。结果 以米根霉和扣囊复膜孢酵母按1∶2接种比例和15%总接种量接种于六神曲基质,32.5 ℃温度下发酵6 d制得六神曲,与同一厂家的9批商品六神曲相比,自制六神曲的酶活力批次间更稳定。结论 优化后的两菌协同发酵六神曲批间质量更加稳定。     

不同产地六神曲消化酶活力测定

目的：测定不同产地六神曲消化酶的活力。方法：以分光光度法测定蛋白酶活力，以容量滴定法测定淀粉酶活力。结果：不同产地六神曲消化酶活力没有显著性差异，六神曲生品蛋白酶、淀粉酶活力均显著高于炮制品。结论：消化酶可作为质量标准，用以控制六神曲的质量。     

六神曲不同的制备工艺对其淀粉酶活力的影响

目的:优化六神曲的制备工艺。方法:采用单因素试验,以六神曲的淀粉酶活力为评价指标,考察发酵时间及原料药的拌曲工艺等因素对六神曲淀粉酶活力的影响;同时将最优制备工艺所制六神曲与市售六神曲的优品和劣品从淀粉酶活力、可溶性淀粉量、可溶性多糖量3个方面进行对比。结果:最佳发酵时间为7 d;赤小豆的最佳处理方法为煮烂拌曲;青蒿、辣蓼、苍耳草的最佳添加方式为以鲜品水煎液混合均匀后拌曲,发酵后六神曲的酶活力可达49.372 mg.min-1.g-1,可溶性淀粉含量可达7.967%,可溶性多糖含量可达16.65%,明显高于市售的2种六神曲。结论:六神曲的最优制备工艺为将赤小豆粉碎后,加入面粉、苦杏仁粉末混合均匀,陆续加入青蒿、辣蓼、苍耳草的鲜品水煎液混合均匀后拌曲,发酵时间为7 d。     

关于改革神曲生产工艺的初步探讨

本文对辽宁传统六神曲生产老工艺作了麦麸代面粉並基质灭菌纯种发酵的改革试验。以蛋白酶和淀粉酶的活力为质量指标(1),对新工艺神曲与老工艺神曲进行了测试比较。表明新工艺合理可行,有—定的实际意义。     

六神曲炮制过程中微生物的分离与鉴定

目的:揭示中药饮片六神曲传统发酵炮制工艺中有益微生物种群。方法:应用经典的微生物分离纯化方法,结合形态学考察和16S rRNA或18S rRNA基因序列分析,对六神曲发酵炮制过程中样品进行微生物的分离及初步菌种分类鉴定。结果:共分离获得细菌8株、酵母菌3株、丝状真菌4株。8种细菌分别为成团泛菌、溶血葡萄球菌、阿氏肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、戊糖片球菌;3种酵母菌分别为伯顿生丝毕赤酵母、汉氏德巴利氏酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母;4种丝状真菌分别为卷枝毛霉、总状毛霉、尔青霉、亮白曲霉。结论:六神曲传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与发酵过程,为后续建立六神曲现代发酵炮制工艺奠定了菌种基础。     

半夏曲发酵机制及主要优势真菌的发酵功能研究

目的 探讨半夏曲的自然固态发酵机制。方法 采用免培养、纯培养相结合的方法研究半夏曲发酵真菌和细菌区系构成及主要代谢功能,针对分离到的主要优势真菌的纯培养菌株,分别采用碘量法及分光光度法检测其产淀粉酶及蛋白酶情况,采用显微镜观察菌株对草酸钙结晶的破坏情况。结果 半夏曲发酵过程中检测到丝衣孢霉Byssochlamys、根霉Rhizopus、曲霉Aspergillus、米勒酵母Millerozyma、假单胞菌Pseudomonas、芽孢杆菌Bacillus等属微生物。半夏曲发酵过程中真菌数量大幅增殖,前期及末期的真菌多样性远远高于发酵旺盛期,发酵40～64 h期间的样品与其他样品的真菌区系构成存在极显著差异(P<0.01)。丝衣孢霉属是唯一参与了整个半夏曲发酵过程的优势真菌,对米勒酵母、根毛霉、曲霉的生长具有明显抑制作用。细菌的数量及多样性均低于真菌,且其数量在半夏曲发酵过程中没有明显增长。微生物群落功能预测(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states,PICRUS)分...     

岭南特色炮制工艺对枳壳挥发油成分的影响

目的:采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对枳壳不同炮制品中挥发油成分进行定性和定量分析,探讨岭南特色炮制工艺中枳壳挥发油成分的变化规律。方法:按照不同工序分别制备枳壳炮制品(生枳壳、麸炒枳壳、清蒸枳壳、单纯发酵枳壳及广东制枳壳),采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,通过GC-MS鉴定不同枳壳炮制品中挥发油成分,运用峰面积归一化法计算各成分的相对质量分数。运用聚类分析和主成分分析分析枳壳不同炮制品中挥发油成分及其含量。结果:从生枳壳、广东制枳壳、单纯发酵枳壳、清蒸枳壳、麸炒枳壳的挥发油中分别鉴定出化合物54,44,25,31,32种。其中岭南特色制枳壳的挥发油中新增化合物最多,且挥发油主要成分含量较生枳壳和麸炒枳壳升高。结论:提示发酵与清蒸相结合的岭南特色炮制方法对改变枳壳炮制品的质量并增强其临床疗效具有重要意义,值得深入研究和进一步推广。     

桃仁制机制探讨

目的:通过比较不同桃仁炮制品的苦杏仁酶活性、苦杏仁苷含量及其毒性大小,探究桃仁的燀制机制。方法:通过苦味酸试纸变色反应测定桃仁中苦杏仁酶的活性。采用HLPC测定不同桃仁炮制品中苦杏仁苷含量,流动相乙腈-0.1%磷酸水(15∶85),检测波长210 nm。利用急性毒性试验比较桃仁不同炮制品的毒性大小。结果:生桃仁可使苦味酸试纸变为红色,桃仁不变色。生桃仁中苦杏仁苷质量分数3.48%,贮藏6个月后苦杏仁苷含量明显降低至2.53%;桃仁中苦杏仁苷质量分数(3.19%)较生桃仁略低,贮藏6个月后苦杏仁苷含量(3.10%)变化不显著。燀桃仁(未去皮)水提物的半数致死量(LD50)55.907 g·kg-1,燀桃仁(去皮)水提物的LD5082.943 g·kg-1。结论:桃仁经燀制后会使苦杏仁酶完全灭活,可防止有效成分苦杏仁苷因酶解而损失。桃仁燀制后去皮可降低毒性,提示桃仁燀后去皮的炮制方式具有合理性,应按照传统后燀去皮用,为桃仁炮制工艺研究及炮制技术规范提供参考。     

白芍发酵菌种及发酵工艺的优选

目的 优选白芍Paeoniae Radix Alba发酵菌种及发酵工艺条件。方法 以白芍与硫磺熏蒸白芍用乳酸菌和酵母菌进行发酵,以活菌数为指标,综合芍药苷定量测定结果,优选白芍发酵菌种及发酵工艺条件。结果 白芍以酵母菌发酵效果为佳;白芍和硫磺熏蒸白芍最佳发酵工艺均以酵母菌加培养基发酵36 h为佳。结论 白芍在发酵过程中,酵母菌发酵效果优于乳酸菌发酵效果,优选的发酵工艺可行。     

不同炮制品入药的青娥丸含药血清对人成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的:研究以不同炮制品入药的青娥丸含药血清对人成骨细胞增殖、分化和矿化的影响。观察盐炙品及生品青娥丸含药血清对人成骨细胞功能的影响,探讨青娥丸对骨质疏松症的治疗机制,阐述应用盐炙品配伍入药的必要性。方法:以绝经后妇女股骨松质骨分离得到的成骨细胞为研究对象,制备以补骨脂和杜仲生品及盐炙品配伍入药的青娥丸,给予大鼠生品及盐炙品青娥丸水提液ig(10mL·kg-1),给药持续7d,第7天采集大鼠血液制备含药血清。实验分为空白组、空白血清组、青娥丸含药血清组、盐青娥丸含药血清组。采用MTT法检测各组含药血清对人成骨细胞增殖的影响;同时测量成骨细胞碱性磷酸酶活性来评价各组含药血清对人成骨细胞分化的作用;采用细胞钙茜素红染色方法对给予含药血清处理的人成骨细胞进行染色,观察对人成骨细胞矿化的影响。结果:与同浓度空白血清比较,青娥丸的生品和盐炙品的含药血清均有促进成骨细胞增殖的作用(P<0.05),且含药血清浓度相同时,青娥丸盐炙品含药血清促进成骨细胞增殖的作用优于生品含药血清(P<0.05);青娥丸生品及盐炙品含药血清具有促进成骨细胞分化的作用(P<0.05),且盐炙品的作用要优于生品(P<0.01);空白血清对成骨细胞的矿化无显著的作用,而青娥丸生品及盐炙品含药血清具有促进成骨细胞矿化结节形成的作用,且盐炙品的作用要优于生品。结论:青娥丸能提高成骨细胞增殖、分化及矿化活性,其对于骨质疏松症的治疗作用与其能显著提高成骨细胞功能有关,且盐炙品入药的青娥丸效果较好。     

不同加工方法对掌叶大黄中蒽醌类和酚酸类成分的影响△

目的:比较熏法、晾法、晒法和烘法对大黄蒽醌类、酚酸类成分的影响,为大黄药材、饮片加工提供依据。方法:采用HPLC分别测定蒽醌类成分、酚酸类成分的含量;并以聚类分析评价。结果:加工方法对大黄中大黄蒽醌类、酚酸类成分有明显影响,传统的熏法中蒽醌类成分含量最高,晾法次之,均可达到《中国药典》的规定,晒法和烘法加工的质量次。结论:熏法推广受到限制,晾法是目前适宜的加工方法。     

采用扫描电镜-能谱仪比较水飞法、水洗法及干研法对雄黄饮片质量的影响

目的:比较雄黄水飞品、水洗品及干研品中二硫化二砷及各元素的含量,以阐明水飞法、水洗法及干研法对雄黄饮片质量的影响,并对雄黄水飞品、水洗品及干研品进行快速鉴别。方法:依据2015年版《中国药典》(一部)雄黄项下规定对3种炮制品进行含量测定;采用扫描电镜-能谱仪对雄黄3种炮制品进行形貌观察,对3种炮制品中的元素种类及含量进行分析。结果:3种炮制品的二硫化二砷含量排序为水飞品水洗品干研品;水飞品及水洗品的形貌相似,而干研品的形貌与其他2种炮制品不同;3种炮制品的氧元素含量排序呈现干研品水洗品水飞品的趋势。结论:采用扫描电镜-能谱仪可以对雄黄水飞品和干研品进行快速鉴别,为鉴别雄黄不同炮制品提供了一定的技术支持。水飞法的除杂减毒效果最好,水飞品质量优于水洗品和干研品,说明水飞法炮制雄黄具有一定的科学依据。     

猪胆汁炮制对黄连中生物碱类成分溶出的影响

目的:比较黄连、胆黄连及其水煎液中生物碱类成分的含量,研究猪胆汁炮制对黄连中生物碱类成分溶出效果的影响,探讨胆黄连寒性增强的炮制机制。方法:采用紫外分光光度法(UV)测定黄连、胆黄连及其水煎液中总生物碱含量,检测波长345 nm。采用高效液相色谱法(HPLC)测定黄连、胆黄连及其水煎液中盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量,流动相乙腈(A)-磷酸三乙胺水溶液(B)梯度洗脱(0~15 min,25%~30%A;15~20 min,30%~55%A),流速1.0 m L·min~(-1),检测波长345 nm。结果:黄连水煎液、胆黄连水煎液中总生物碱的转移率分别为71.17%和78.50%;黄连水煎液中盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的转移率分别为73.93%,51.59%,56.16%;胆黄连水煎液中三者的转移率分别为80.42%,64.21%,64.79%。结论:黄连经猪胆汁炮制后能够增加黄连中生物碱类成分在水煎液中的溶出,可达到寒性增强的炮制目的。     

HS-SPME-GC-MS分析温郁金不同炮制品的挥发性成分

目的:对温郁金生品、醋制品和酒制品中的挥发性成分进行分析和比较,找出他们之间功效差异的物质基础,为临床合理使用温郁金不同炮制品及建立其更加完善的质量评价体系提供有力参考。方法:采用顶空固相微萃取技术(HSSPME),结合气相色谱-质谱法(GC-MS)对温郁金不同炮制品之间的挥发性成分及其相对百分含量进行对比分析。结果:从温郁金生品中初步检测出42个峰,鉴定出23个成分;从醋制品中检测出59个峰,鉴定出34个成分;从酒制品中检测出64个峰,鉴定出40个成分。与生品相比,醋制品中新增了22种成分,酒制品中新增了29种成分;温郁金不同炮制品中的挥发性成分的组成和含量均发生了变化。结论:顶空固相微萃取法操作简便、萃取速度快,不使用有机溶剂,不污染环境,操作成本小;采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联合使用的方法稳定性强可靠程度高,其适用于温郁金及其不同炮制品之间挥发性成分的快速分析,可为温郁金及其不同炮制品质量评价提供一定的科学依据,并为温郁金资源的合理利用提供科学参考。     

款冬花不同炮制品的HPLC指纹图谱比较

目的:采用HPLC指纹图谱技术,综合运用相似度评价、聚类分析(CA)及主成分分析(PCA)对款冬花炮制前后化学成分变化进行研究。方法:采用HPLC-DAD建立10个产地款冬花不同炮制品的指纹图谱,流动相乙腈-0.03%三氟乙酸水溶液梯度洗脱,检测波长240 nm;运用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"(2004A版)软件,CA及PCA综合探索款冬花不同炮制品的质量及成分变化规律。结果:建立了不同炮制品的HPLC共有模式,款冬花生品、蜜炙品、甘草炙品指纹图谱的相似度分别为0.867~0.991,0.785~0.979,0.785~0.980。CA将不同炮制品均分为4类,与相似度评价结果基本一致,表明不同产地间款冬花炮制品具有一定的相似性和稳定性。PCA筛选出方差累计值达74.230%的2个主成分,并得到与之相关的成分群,不同产地炮制品的综合得分情况表明该成分群在生品、蜜炙品及甘草炙品中稳定存在。结论:指纹图谱技术结合相似度评价,CA,PCA能对款冬花炮制品的质量进行系统评价,可为其他中药炮制品的评价提供参考。