大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的：仿照前人建立的方法，优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法，为后续相关研究建立实验室条件。方法：使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞，以DMEM为培养基体外培养，光镜观察。采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果：培养的细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，细胞质丰富，折光性好。电镜下可见特征性的中间丝（直径8～10nm），细胞器丰富；荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶（GS）阳性。结论：酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法。     

两种大鼠视网膜Müller细胞培养方法比较

目的比较酶消化法与组织块法培养大鼠视网膜Müller细胞的效果。方法将新生3d的SD大鼠视网膜分离为小组织块,分别采用酶消化法与组织块法进行体外培养,采用换液时机械震荡等方法获得纯化的Müller细胞。从细胞形态学、细胞增殖及免疫细胞化学染色阳性率方面比较两种细胞培养方法的效果。结果酶消化法获得的Müller细胞数量多于组织块法(t=2.264,P<0.05),且用时短。两种方法培养的纯化Müller细胞增殖速度及免疫细胞化学染色阳性率比较差异无显著意义(P>0.05)。结论酶消化法是一种高效的大鼠视网膜Müller细胞培养方法。     

一种改良的Sprague Dawley新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法

目的改良Sprague Dawley(SD)新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法。方法取新生1～2 d的SD,分2 d完成视网膜Müller细胞的提取,第1天将眼球浸泡于含体积分数1%双抗的无血清高糖达尔伯克改良伊戈尔培养基(DMEM)中,置于37℃、含体积分数5%CO2的培养箱内过夜;第2天,去培养基,以2. 5 g·L-1胰蛋白酶消化眼球1 h,分离视网膜组织,加入含体积分数1%双抗和体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,制备细胞悬液接种培养; 24 h后换液,6～8 d后传代,传至第4代,细胞免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度。结果 Müller细胞贴壁生长良好,细胞体宽大,细胞质丰富,细胞核呈圆形或椭圆形,无神经元共生长,Müller细胞纯度> 95%。结论改良的SD新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法操作简单,细胞纯度高。     

牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞凋亡的防护研究

目的 观察高糖培养条件及牛磺酸干预视网膜Müller细胞的凋亡变化,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用.方法 取出生后3 d的SD大鼠视网膜,分离纯化培养视网膜Müller细胞;经预实验选取25 mmol/L葡萄糖作为高糖培养条件,实验分为6组:正常组;高糖 0.1 mmol/L牛磺酸组;高糖 1 mmol/L牛磺酸组;高糖 5 mmol/L牛磺酸组;高糖 10 mmol/L牛磺酸组,用原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测视网膜Müller细胞凋亡并观察牛磺酸的防护效应.结果 神经胶质酸性蛋白(glia1 fibrillary acid protein, GFAP)和S-100荧光双染鉴定纯化培养的视网膜Müller细胞均被双染;牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量明显减少,并呈一定剂量的关系效应,1～10 mmol/L牛磺酸干预TUNEL阳性细胞显著低于高糖培养组(P＜0.01).结论 牛磺酸能够呈剂量依赖性地抑制高糖所致视网膜Müller细胞凋亡.     

高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法体外培养兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学方法半定量检测不同浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞表达VEGF的影响。结果高糖可以明显增加Müller细胞VEGF的表达,且具有一定的浓度依赖性。结论高糖促进体外培养兔视网膜Müller细胞VEGF的表达,提示高血糖作为糖尿病视网膜病变(DR)的始动因素,其可能机制之一为诱导Müller细胞VEGF的表达。     

糖基化终产物对视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响.方法 体外分离并培养兔视网膜Müller细胞.37℃条件下制备牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物.应用AGEs-BSA及其对照物作用于Müller细胞,采用免疫细胞化学(ICC)方法半定量检测AGEs对视网膜Müller细胞表达bFGF的影响.结果 与对照组相比,AGEs作用下体外培养的兔视网膜Müller细胞bFGF的表达增高(P＜0.05或P＜0.01),且具有一定的时间和浓度依赖性.结论 AGEs可以上调Müller细胞表达bFGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达从而加速糖尿病视网膜病变(DR)新生血管的形成.     

藏红花素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法:将SD大鼠随机分为四组:正常对照组、缺血再灌注模型组,藏红花素给药高剂量和低剂量组。造模前3 d藏红花素给药组动物给予藏红花素腹腔注射,1次/d。通过提高眼内压复制视网膜缺血再灌注模型。再灌注后24 h处死动物,迅速摘除眼球并固定视网膜。免疫组织化学染色法观察胶质细胞酸性蛋白(GFAP)在视网膜的表达量,使用电镜观察视网膜细胞结构。结果:模型组大鼠视网膜GFAP表达量显著增加,该组大鼠视网膜超微结构为Müller细胞突起增多,电子密度增加以及中间丝蛋白成束排列。藏红花素给药高剂量组[50 mg/(kg·d)]GFAP表达量较模型组显著降低。结论:藏红花素能通过阻止Müller活化有效保护视网膜免受缺血再灌注损伤。     

体外不同压力对视网膜Müller细胞的GLAST表达的影响

目的:研究不同压力对体外培养的视网膜Müller细胞形态、活性和L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)表达的影响。方法:按不同压力将Sprague Dawley大鼠Müller细胞第4代细胞随机分为5组,其中对照组为A组(+0mmHg),实验组分别为B组(+15mmHg)、C组(+30mmHg)、D组(+45mmHg)、E组(+60mmHg),每组3瓶,37℃,5%CO2培养箱培养2h。倒置显微镜观察Müller细胞形态;噻唑蓝比色法(MTT)测定波长570nm处的吸光度(A)值,以各组A值计算细胞相对存活率;免疫蛋白印迹法(Western blot)检测各组大鼠视网膜Müller细胞上GLAST的蛋白表达。结果:光镜下,与对照组相比,体外培养的视网膜Müller细胞经不同压力处理下形态改变不明显。MTT检测显示,A、B、C、D、E组A值分别为1.676 3±0.054 7、1.503 3±0.053 6、1.209 3±0.045 5、1.020 0±0.040 0、0.706 3±0.034 1,细胞相对存活率分别为100%、89.3%、71.3%、59.7%、40.3%。其中,B、C、D、E组A值均较A组降低(P<0.05)。随着压力的升高,细胞相对存活率逐渐降低,各组间总体差异均有统计学意义(P<0.05);Western blot检测显示,与A组相比,其余各组的大鼠视网膜Müller细胞的GLAST蛋白表达均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠视网膜Müller细胞上GLAST的蛋白表达随着压力的升高逐渐降低,各组间总体差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:压力直接影响体外培养的Müller细胞存活状况。随压力升高,大鼠视网膜Müller细胞存活率下降,且细胞上的GLAST的蛋白表达下降。     

糖基化终产物对体外培养兔视网膜Müller细胞的影响

目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞的影响.方法 培养兔视网膜Müller细胞,体外制备AGEs及其对照物,实验分为牛血清白蛋白AGE(AGE-BSA)作用3 d组、AGE-BSA作用9 d组、AGE-BSA对照3 d组、AGE-BSA对照9 d组、空白对照3 d组及空白对照9 d组.采用光镜下观察及流式细胞仪检测AGEs对Müller细胞凋亡发生率的影响.结果 AGEs对Müller细胞作用3 d后,与对照组相比,细胞形态和数量无明显变化,无明显细胞凋亡;而作用9 d后,细胞数量明显减少,细胞凋亡率明显增高.结论 AGEs可抑制视网膜Müller细胞的生长.     

色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞形态及活性的影响

目的检测色素上皮衍生因子(PEDF)对高糖刺激下体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞形态及活性的影响,探讨PEDF对Müller细胞的保护作用。方法实验分为对照组、高糖模型(HG)组、PEDF干预高糖模型(HG+PEDF)组。采用反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度,应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、CCK-8试剂盒、SOD试剂盒及MDA试剂盒检测各组Müller细胞形态与活性的改变及超氧化物歧化酶(SOD)活力与丙二醛(MDA)含量的变化。结果对照组、HG组、PEDF+HG组细胞吸光度分别为0.67±0.03、0.54±0.03、0.63±0.03,SOD活力分别为(196.69±22.15)、(153.42±15.54)、(180.32±16.47)U/mg prot,M DA含量分别为(2.11±0.43)、(2.86±0.33)、(2.40±0.28)nmol/mg prot。与对照组相比,HG组Müller细胞形态发生明显改变,细胞活性及SOD活力降低(P<0.01),M DA含量升高(P<0.01);与HG组相比,PEDF+HG组Müller细胞形态改变较小,细胞活性升高(P<0.01),SOD活力升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05)。结论外源给予PEDF可显著减轻高糖所致的Müller细胞形态、活性的改变及细胞损伤,对Müller细胞具有显著的保护作用。     

高糖条件下沉默LRP6通过Wnt/β-catenin途径抑制大鼠视网膜Müller细胞的自噬与凋亡

目的:探究在高糖作用下大鼠视网膜Müller细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达及其对高糖条件诱导的Müller细胞自噬与凋亡的作用和机制。方法:体外培养大鼠视网膜Müller细胞,采用RT-PCR与Western blotting检测高糖条件下Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平;利用siRNA干扰技术沉默Müller细胞中的LRP6,并分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1(NG)与35 mmol·L^-1的DMEM培养液(HG)中进行培养,按处理方式的不同将Müller细胞分为葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^-1的DMEM培养的正常葡萄糖组(NG组)、葡萄糖浓度为35 mmol·L^-1的DMEM培养的转染si-NC组(HG+si-NC组)和si-LRP6的Müller细胞组(HG+si-LRP6组);采用Western blotting检测各组Müller细胞中自噬相关蛋白P62的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体的表达;共...     

高糖对视网膜Müller细胞碱性成纤维细胞生长因子表达及钙离子通道的影响

目的：观察在高浓度葡萄糖条件下体外培养兔视网膜Müller细胞碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的表达及其钙（Ca2+）通道的变化。方法：采用免疫细胞化学及透射电镜方法鉴定体外培养的兔视网膜Müller细胞;应用免疫细胞化学方法定性观察高糖条件下视网膜Müller细胞bFGF表达的变化;利用膜片钳技术观察高糖条件下Müller细胞Ca²⁺通道的变化。结果：高糖可以刺激视网膜Müller细胞表达bFGF,对Ca²⁺通道无明显影响。 结论：高糖刺激Müller细胞bFGF的表达,而发挥促血管生成的作用,在此过程中Ca²⁺通道无明显变化。     

兔视网膜Müller细胞原代培养

目的 :建立兔视网膜 Müller细胞原代培养的方法。方法 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞 ,用电镜和免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 :培养的细胞贴壁生长 ,呈长梭形 ,胞体肥大 ,胞浆丰富。电镜下可见特征性的中间丝 (直径 8～ 1 0 nm) ;免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP)和 S- 1 0 0阳性 ,八因子相关抗原阴性。结论 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法     

高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素对体外培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响.方法 采用荧光探针技术,应用激光共聚焦显微镜动态、定量测定细胞外高钙、钙拮抗剂条件下,正常、高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖+高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的变化.结果 高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖+高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高,在细胞外高钙条件下各组[Ca2+]i均降低,在细胞外钙拮抗剂条件下各组[Ca2+]i均再次下降.结论 高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素均能使视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高,而钙拮抗剂通过干扰细胞外钙离子进入细胞来降低[Ca2+]i.     

AQP4与Kir4.1在大鼠眼内组织的共表达

目的:探讨AQP4与Kir4.1在大鼠眼内的定位分布及二者的共表达.方法:用免疫组织化学及激光扫描共聚焦显微技术检测AQP4与Kir4.1在大鼠眼内的分布.结果:免疫荧光显示,AQP4与Kir4.1在大鼠视网膜和睫状体内的分布形式相似;免疫荧光双标显示,AQP4与Kir4.1在视网膜Müller细胞及睫状突无色素上皮细胞的顶膜面及基底膜面呈重叠分布.结论:AQP4与Kir4.1在大鼠视网膜Müller细胞及睫状突无色素上皮细胞共表达,提示二者可能具有协同作用,参与房水的产生以及视网膜内水、K 运输平衡的调节.     

胰岛素对视网膜Müller细胞生长活力的影响

目的:研究不同浓度胰岛素对视网膜Müller细胞生长活力的影响,探讨Müller细胞在视网膜神经损伤中的作用.方法:取兔视网膜Müller细胞进行培养及鉴定.取第3代细胞.应用MTT测定方法,测定1U/ml、4U/ml、8U/ml、12U/ml胰岛素分别在6小时、12小时、24小时对视网膜Müller细胞增殖的影响.结果:在胰岛素作用6h、12h时,均为4U/ml浓度组MTT值最高,与对照组的差异最显著(F值5.60、7.31,均P<0.001).结论:不同浓度胰岛素在一定浓度范围、一定作用时间内,对视网膜Müller细胞的生长有显著的促进作用.     

花色苷对高糖高胰岛素培养下Müiller细胞的保护

目的:观察高糖高胰岛素作用下Müller细胞的活性改变及花色苷对其的保护作用.方法:用50 mmol/L葡萄糖和不同浓度胰岛素处理大鼠视网膜Müller细胞24 h,分为高胰岛素组:3 kU/L胰岛素;低胰岛素组:3 U/L胰岛素;对照组:不含胰岛素.分别用121.1,22.8,0μmol/L花色苷对各组细胞进行保护.48 h后用MTT法测定Miller细胞的活性.结果:高胰岛素(3 kU/L)处理后Müller细胞活性降低(P＜0.05),低胰岛素组(3 U/L)则与对照组无显著性差异(P＞0.05).在低胰岛素和高胰岛素组中,经高浓度花色苷处理过的Müller细胞较未加入花色苷的Müller细胞活性提高(P＜0.05),且与未经胰岛素处理的Müller细胞相比差异消失(P＞0.05);而低浓度花色苷无此作用(P＞0.05).结论:高浓度胰岛素在短期内可使Müller细胞的活性降低,一定浓度的花色苷可恢复高胰岛素对Müller细胞活性的改变.     

牛磺酸对高原缺氧大鼠视网膜形态结构及SDH、LDH活性的影响

目的观察急性持续性高原缺氧条件下视网膜结构、功能变化,探讨牛磺酸对视网膜缺氧损伤的保护作用.方法以低压舱模拟4 500 m和5 500 m高原条件,SD大鼠经2.4%牛磺酸干预后入舱缺氧.光镜观察视网膜层状结构,检测琥珀酸脱氢酶(SDH)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化,电镜技术观察视网膜Müller细胞的超微结构.结果缺氧使内核层、内网状层和节细胞层受损.缺氧早期内网状层细胞移行高于对照组(P＜0.05),4500 m时牛磺酸促进细胞的移行,5500 m早期抑制细胞移行.缺氧后Miiller细胞肿胀,核崩解,细胞器变形,添加牛磺酸损伤减轻.缺氧导致SDH与LDH活性显著下降(P＜0.05),牛磺酸能上调其活性(P＜0.05).结论缺氧引起视网膜内层细胞出现损伤,牛磺酸能显著提高SDH、LDH的活性,减轻视网膜的缺氧损伤,其保护作用与Müller细胞的功能和结构维持相关.     

糖尿病兔视网膜bFGF的表达及定位

目的：探讨糖尿病兔视网膜碱性成纤维生长因子(bFGF)的表达时期及bFGF表达增加与视网膜 Müller细胞的相关性。 方法：16只大耳白兔随机分为正常对照组及糖尿病组,建立糖尿病兔模型,饲养7周后,取材并通过激光共聚焦显微镜应用免疫荧光双重标记方法观察视网膜,对bFGF进行定位。 结果：正常对照组兔眼视网膜各层结构清晰,细胞排列紧密、整齐,细胞形态正常,GFAP免疫荧光标记,显现红色荧光的部位为兔视网膜Müller细胞。bFGF免疫荧光标记仅在毛细血管基底膜处呈现红色荧光;糖尿病组兔视网膜各层结构清晰,内核层、神经节细胞层细胞排列疏松,细胞间隙增大,细胞形态与正常对照组无明显差异,可见出血未见血管新生,bFGF 免疫荧光标记,视网膜各层细胞均见不同强度的红色荧光,GFAP及bFGF双重免疫荧光标记,视网膜可见黄色荧光。糖尿病兔模型的视网膜病变为BDR期;bFGF在BDR期表达增加;bFGF与GFAP共同表达于视网膜Müller细胞。 结论：bFGF在BDR期即开始在视网膜Müller细胞中表达。     

暗饲养对视神经横断后SD大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的探讨视神经横断后Müller细胞在改善视网膜节细胞轴突再生微环境及其对光信号传递突触的保护作用。方法实验建立视神经横断模型,随机分成正常昼夜循环组及黑暗饲养组,用免疫组织化学及Western blot法检测视神经横断后,SD大鼠在正常昼夜循环条件及黑暗条件下饲养时视网膜谷氨酰胺合成酶随饲养时间延长的表达变化;Nissl染色法观察相应视网膜节细胞的形态结构改变。结果正常昼夜循环饲养的大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶的表达于视神经横断后持续减少,5 d时达最低值;暗饲养的大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶的表达于视神经横断后3 d时最低,5~7 d时持续增加。Nissl染色显示暗饲养组大鼠视网膜节细胞14d时存活较多。结论正常昼夜循环条件视神经横断后Müller细胞谷氨酰胺合成酶的表达呈应激性反应,暗饲养能在突触溃变关键期维持视网膜内谷氨酰胺合成酶的表达强度。