融合蛋白胸腺素α-干扰素与干扰素α对2.2.15细胞抗原表达的影响

临床上许多学者把α干扰素（IFN-α）和胸腺素α（TA1）联合起来治疗慢性乙型肝炎,结果发现联用效果明显优于单用IFN-α或TA1[1].     

聚乙二醇化干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎的临床研究

目的评价聚乙二醇化干扰素（PEG-IFN）α-2a治疗慢性乙型肝炎（CHB）的疗效和安全性。方法72例CHB患者随机分配到治疗组和对照组。治疗组（30例）予PEG-IFN α-2a 180μg皮下注射，每周1次，疗程48周。对照组（42例）予普通干扰素500 MU，皮下注射，隔日1次，疗程48周，治疗结束后随访48周。结果治疗12周时，治疗组乙型肝炎e抗原（HBeAg）的阴转率达到30％，明显高于对照组，x^2=4．162，P〈0．05，HBeAg定量及乙型肝炎病毒（HBV DNA）定量对数值明显低于治疗前水平，t值分别为2．689、4．080，P〈0．01，而对照组治疗12周时与治疗前相比，差异无统计学意义，t值分别为1．229、1．009，P〉0．05；治疗24周时，治疗组乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴转率明显高于对照组，x^2=6．190，P〈0．05，HBeAg定量和HBV DNA定量的对数值均明显低于对照组，t值分别为2．215、2．122，P〈0．05；治疗48周时，治疗组除上述观察指标优于对照组外，HBeAg／抗-HBe血清转换率、丙氨酸氨基转移酶的复常率及完全应答率也明显高于对照组，x^2值分别为5．771、5、617、5、308，P〈0.05；治疗结束后随访48周时，治疗组HBeAg的阴转率、HBeAg定量、HBV DNA定量对数值、HBeAg／抗-HBe血清转换率、丙氨酸氨基转移酶的复常率及完全应答率均明显优于对照组，分别为x^2=11．943、t=3、439、f=6、111、x^2=9．930、x^2=9、522、x^2=7．920，P值均〈0．01，而且保持持续应答，而对照组的应答率则有所下降；治疗组9例患者于治疗前后做2次肝活组织检查，治疗前肝组织中的乙型肝炎表面抗原及核心抗原阳性率分别为88、89％和66、67％，治疗结束时分别为22．22％和33、33％，乙型肝炎表面抗原较治疗前明显减少，x^2=8、001，P〈0、01；治疗前后肝组织的炎症活动度、纤维化程度及胶原表达无明显差异。治疗组有3例出现HBsAg阴转，阴转率为10％，其中2例出现在治疗后32周，1例出现在治疗结束后24周，对照组无一例阴转。PEG-IFNα-2a的不良反应与对照组相似。结论PEG-IFNα-2a治疗慢性乙型肝炎能有效地抑制其病毒复制，且能持续应答，治疗48周内安全且耐受性良好。     

重组人干扰素α-2b/免疫球蛋白G4 Fc融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达

目的 利用杆状病毒昆虫系统表达人干扰素(IFN) α-2b/免疫球蛋白(Ig)G4Fc融合蛋白(IFN/Fc),为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法.方法 利用分子克隆技术获得人IFN α -2b及IgG4 Fc基因cDNA,构建杆状病毒穿梭载体,在DH10 Bac菌株中转座获重组杆粒,转染昆虫细胞High five,Western blot检测目的蛋白表达,细胞病变抑制法检测生物学活性. 结果 穿梭载体在DH10 Bac中转座成功,获得重组杆粒Bacmid-IFN/Fc ; High Five细胞在病毒感染后72 h蛋白表达较好.病毒感染48 h即有少量目的蛋白表达,72 h表达量较高.Western blot结果显示在45×103处有特异性蛋白条带,体外抗病毒活性为580 IU/ml.结论 利用杆状病毒昆虫系统成功表达重组IFN/Fc融合蛋白,为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据.     

抗HBsAg Fab片段和α-干扰素融合蛋白的克隆及表达

目的 为深入研究乙型肝炎的生物导向治疗，构建以人抗乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗本Ｆａｂ片段国导向作用，αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）为治疗作用的融合蛋白Ｆａｂ／ＩＦＮ－αＡ原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ。方法 用ＰＣＲ体外扩增目的基因ＩＦＮ－αＡ，并在其ＤＮＡ两端引入酶切点及５′端人工合成的Ｌｉｎｋｅｒ，重组人抗ＨＢｓＡｇ缺本Ｆａｂ片段功体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切位点，酶切和ＤＮＡ测序鉴定筛选     

乙型肝炎病毒转染及脂多糖刺激对HepG2细胞Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)转染对HepG2细胞表面Toll样受体(TLR)表达的影响及脂多糖(LPS)加重HBV转染致肝细胞损伤是否存在直接作用,进一步探讨乙型肝炎发病及重型化的发生机制。方法以不同浓度的LPS刺激HepG2细胞、HepG2．2．15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞),并以免疫细胞化学方法检测HepG2细胞及HepG2．2．15细胞表面TLR 2、4蛋白质表达情况,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR2、4 mRNA表达情况,用Abbot试剂检测HepG2．2．15细胞HgsAg和HgeAg表达情况,用流式细胞仪观察细胞生长周期及细胞凋亡情况。结果HepG2、HepG2．2．15细胞膜上均有TLR2、4蛋白质表达,免疫细胞化学染色在未加LPS及各浓度LPS刺激细胞均可见细胞膜有棕褐色着色,且随着LPS浓度增加,其着色强度增加;对0mg/L及10mg/L LPS诱导HepG2、HepG2．2．15细胞RNA进行RT-PCR扩增,其产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳均可见特异性条带,且10mg/L LPS诱导细胞TLR2和TLR4与分子量标准品的吸光度值比值明显高于0mg/L LPS诱导细胞扩增产物,分别为306．63±6．18对519．84±9．15和700．54±13．56对1116．62±37．67,F值分别为740．58和426．07,P值分别为0．01和0．02;流式细胞仪检测细胞周期发现HepG2绌胞及未经LPS诱导的HepG2．2．15未发生凋亡,各浓度LPS诱导的HepG2．2．15细胞均有细胞凋亡发生,且细胞凋亡率随着LPS浓度增加上升。结论LPS可能通过其与肝细胞膜上的TLR结合,而参与HBV转染后肝细胞损害及肝脏炎症重型化的发病机制。     

人源M2三联体靶抗原BPO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的用基因工程的方法克隆表达抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的3个靶抗原侧链二氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）及其连接形成的三联体BPO-E2融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断。方法针对BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的cDNA序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取RNA，通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pET28a（＋），构建重组表达载体pET28a（＋）-BCOADC-E2、pET28a（＋）-PDC-E2、pET28a（＋）-OGDC-E2、pET28a（＋）-BPO-E2，转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western-blot等鉴定。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了4种重组质粒。IPTG诱导表达后，获得4种融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性。结论重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验室诊断。     

融合蛋白胸腺素α1-干扰素α抗乙型肝炎病毒活性的实验研究

目的观察融合蛋白胸腺素α1-干扰素α(TA1-IFN)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用,并与胸腺素α1、干扰素α两者联合(TA1+IFN)应用的体外抗HBV作用进行比较。方法HepG22.2.15细胞接种后24h,换用含5种不同浓度(8000、4000、2000、1000、500U／ml)药物的培养基,37℃、体积分数5％CO2条件下培养,每3d换用原浓度含药培养液1次,并于第6天收集培养液,用Abbott诊断试剂盒,分别检测不同组药物作用后上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的含量,并计算其抑制率;同时用四甲基偶氮唑盐比色分析法检测不同组药物对HepG22.2.15细胞的细胞毒性作用。结果TA1-IFN体外对HBsAg、HBeAg的抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系,并且在药物浓度达8000U／ml后趋于稳定,此时TA1-IFN对HBsAg、HBeAg抑制率分别为72.2％±0.8％、60.4％±1.1％,细胞存活率为85.2％±2.0％;而相应浓度的TA1-IFN对HBsAg、HBeAg抑制率为40.0％±0.7％、34.5％±3.2％,细胞存活率为70.0％±1.9％,两者HBsAg、HBeAg抑制率及细胞存活率比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论融合蛋白TA1-IFN体外具有良好的抗HBV作用,其体外抗HBV活性比TA1-IFN联合应用强,且细胞毒性比TA1+IFN联合应用时小,本实验为融合蛋白TA1-IFN的临床研究提供了重要的理论     

人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析

目的获得人源性乙型肝炎病毒前Ｓ２抗体轻链基因。方法用人工合成的乙型肝炎病毒前Ｓ２短肽（Ｐｒｅ－Ｓ２,１２０—１４５）,从已构建的人源性噬菌体抗体库中,得到了针对Ｐｒｅ－Ｓ２阳性克隆,经竞争抑制实验证明其特异性和活性,合成一对轻链引物,经ＰＣＲ扩增,亚克隆入质粒ＰＵＣ１８进行序列测定及分析、结果筛选到的阳性克隆具有乙型肝炎病毒前Ｓ２特异性亲和力。构建了ｐＵＣ１８－ Ｐｒｅ－Ｓ２ｋ。轻链重组质粒,序列分析其为人ｋ轻链,包括了完整的恒定区和可变区,大小为 ６４５ ｂｐ。结论利用抗原抗体特异性反应原理,从人源性噬菌体抗体库中筛选到人抗ＨＢＶ前Ｓ２抗体ｋ轻链     

10-23脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的在细胞水平上探讨10-23脱氧核酶（10—23DRz）成为新型乙型肝炎基因治疗药物的可能性。方法设计合成针对乙型肝炎病毒（HBV）ayw1亚型前C／C区的2031位点的1023DRz，并对其进行硫代磷酸化修饰，同时针对该位点设计一条未硫代化修饰的10—23DRz，经脂质体转染HePG22．2．15细胞（简称2．2．15细胞）中观察其对HBV基因表达的抑制效应。结果修饰与未修饰的1023DRz作用于2．2．15细胞后均可显著抑制乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）的表达，最高抑制率分别可达93．75％和90．26％，有效抑制持续时间可达96h，修饰后的脱氧核酶在细胞内对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用时间长于未修饰的DRz，其抑制率的最高值低于未修饰的DRz，但两者明显高于作为对照的反义脱氧寡核苷酸。对2．2．15细胞内HBVDNA复制无明显影响，未见明显的细胞毒性作用。结论经过硫代化修饰的1023DRz和未修饰的l023DRz在2．2．15细胞模型中能高效阻断HBVDNA的表达，是一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。     

乙型肝炎表面抗原水平下降预测 e 抗原阴性患者聚乙二醇干扰素-α-2a 治疗中表面抗原消失的研究

目的：探讨 HBeAg 阴性 CHB 患者在干扰素抗病毒治疗过程中 HBsAg 水平的变化对治疗中 HBsAg 消失或血清学转换的预测作用。方法2008年5月至2011年8月于首都医科大学附属北京地坛医院就诊的 HBeAg 阴性 CHB 初治患者,HBsAg 阳性、血清 HBV DNA 阳性持续6个月以上, ALT 异常3个月以上,收集的患者包括聚乙二醇干扰素-α-2a （peg-IFN-α-2a）治疗3个月以上的在治疗患者和已治疗结束的患者。入组患者给予 peg-IFN-α-2a 180μg／周皮下注射治疗,治疗前和治疗期间每间隔3个月检测血清 HBV DNA、HBsAg 水平和抗-HBs,以 HBsAg 消失为主要疗效评价指标。组间差异采用卡方检验,应用受试者工作特征（ROC）曲线预测治疗12周和治疗24周的 HBsAg 水平绝对值和HBsAg 下降幅度对治疗96周和120周时 HBsAg 的消失。结果共有81例患者进入数据分析,根据患者治疗中 HBsAg 下降所达到的水平分为完全应答组12例（14．8％）,部分应答组20例（24．7％）和应答不佳组49例（60．5％）。治疗12周完全应答组和部分应答组 HBsAg 水平值下降幅度分别为0．62（0．06,0．91）lg IU／mL 和0．19（－0．01,0．48）lg IU／mL,两组比较差异无统计学意义（Z ＝1．581,P ＝0．209）,在调整基线的差异后（计算患者下降幅度的中位数）,完全应答组和部分应答组下降幅度均高于应答不佳组的下降幅度0．00（－0．01,0．14）lg IU／mL,χ2＝9．00,P ＜0．01]。治疗24周,3组间 HBsAg的下降幅度差异均有统计学意义（χ2＝27．72,P ＜0．01）。无论预测治疗96周还是120周治疗的HBsAg 消失,24周HBsAg 临界值的预测能力均强于12周,ROC 曲线下面积均差异有统计学意义（χ2值分别为＝3．880和4．412,P 值分别为0．049和0．036）。结论治疗早期 HBsAg 水平变化可预测peg-IFN-α-2a 治疗 HBeAg 阴性 CHB 患者疗效。     

乙型肝炎病毒前S2与α-干扰素融合基因的构建

乙型肝炎病毒前S2(HBV PreS2)基因编码蛋白含55个氨基酸残基,具有聚合人血清白蛋白受体(pHSA-R)活性,是HBV感染嗜肝性的重要机制之一,并在诱导机体产生保护性免疫应答中起重要作用。α-干扰素(IFN-α)是一种多功能免疫调节因子,可诱导机体产生抗病毒蛋白。将上述两种基因融合表达有可能显著增强小分子前S2蛋白的免疫原性     

延长聚乙二醇干扰素α-2a疗程对乙型肝炎表面抗原消失/血清学转换的影响

目的 探讨延长聚乙二醇干扰素α-2a疗程对慢性乙型肝炎患者获得HBsAg消失/血清学转换的影响.方法将217例慢性乙型肝炎患者根据体质量分为＜60 kg和≥60 kg两组,分别皮下注射聚乙二醇干扰素α-2a 135μg或180 μg,治疗过程中根据患者外周血中性粒细胞数和血小板数调整药物剂量.每3个月采用酶免疫化学发光法定量检测HBsAg/抗-HBs、HBeAg/抗-HBe,HBV DNA采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测,将治疗时间＞12周的患者纳入统计分析,在治疗过程中,对HBV DNA、HBsAg含量降低的患者,HBeAg含量下降的HBeAg阳性患者,治疗48周后HBsAg含量＜200 IU/ml患者进行延长治疗,经意向性分析治疗患者HBsAg血清学转换发生率.采用x2检验进行统计学分析.结果 217例慢性乙型肝炎患者,治疗时间为12.0～197.6周,平均(53.1±33.4)周,其中118例患者治疗时间≥48周,89例治疗时间＜48周.13.4%(29/217)的患者获得HBsAg消失/HBsAg血清学转换,其治疗时间为17.6～197.6周,平均(75.4±42.8)周,其中治疗时间＞48周24例(82.8%),小于48周5例(17.2%);HBV DNA平均转阴时间为(20.8±8.9)周.148例HBeAg阳性患者中,9.5%(14/148)的患者获得HBsAg消失/血清学转换,在获得HBsAg消失/血清学转换的患者中,治疗时间均＞48周(54～194周),平均(81.3±39.4)周.21.7%(15/69)的HBeAg阴性患者获得HBsAg消失/血清学转换,与HBeAg阳性患者的HBsAg消失/血清学转换率(9.5%)比较,x2=6.129,P=0.013,差异有统计学意义.获得HBsAg消失/血清学转换的患者中,HBeAg阴性患者平均治疗时间为(70.2±48.0)周,HBeAg阳性患者(81.3±39.4)周,差异无统计学意义(t=-0.522,P=0.602).结论 对聚乙二醇干扰素α-2a治疗HBV DNA和HBsAg应答良好的慢性乙型肝炎患者,延长疗程可提高HBsAg消失/血清学转换率,HBeAg阴性患者比HBeAg阳性患者更容易通过延长聚乙二醇干扰素α-2a治疗获得HBsAg的消失/血清学转换.

Abstract：

Objective HBsAg loss and seroconversion in patients with chronic hepatitis B leads to long-lasting good clinical outcomes. The aim of this paper was to investigate to improve the rate of HBsAg loss and seroconversion in chronic hepatitis B patients by prolonged treatment of PEG-IFN α -2a. Methods 217 cases of HBeAg-positive or negative patients were collected from inpatient and outpatient in Beijing Ditan Hospital from May 2005 to October 2009 and subcutaeous injection of 135μg or 180μg PEGASYS were given once a week acording to body weights. The drug doses were adjusted acording to the neutrophilic granulocyte and platelet counts during treament course. Quantitative HBV DNA test was conducted using a commercially available real-time fluorescence quantitative PCR kit. The serum HBsAg/anti-HBs and HBeAg/anti-HBe were quantitatively detected by Abbott i 2000 chemiluminescent kit before and during treatment every three months. Patients with HBsAg steadily decreased and reached serum HBsAg level below 200 IU/ml after 48 weeks of treatment would receive prolonged treatment. Patients with more than 12 weeks of treatment entered into analysis. Main efficacy of prolonged treatment was evaluated by the incidences of HBsAg loss and seroconversion. Results The treatment courses of the 217 patients ranged from 12.0 to 197.6weeks with an average of 53.1±33.4 weeks, 118 cases took more than 48 weeks and another 89 cases less than 48 weeks. 13.4% (29/217) of patients achieved HBsAg loss or HBsAg seroconversion with treatment courses from 17.6 to 197.6 weeks (average 75.4±42.8 weeks). Among these 29 patients 24 (82.8%) received more than 48 weeks of treatment, but the treatment courses of HBV DNA reached undetectable level were 20.8±8.9 weeks. In this study, 9.5% (14/148) of HBeAg-positive patients acchieved HBsAg loss or seroconversion, all of them treated more than 48 weeks, from 48 to 194 weeks, average 81.32 ± 39.36 weeks.21.7% (15/69) of HBeAg-negative patients achieved HBsAg loss or seroconversion, significantly higher than that of HBeAg-positive patients (9.5%) (x2=6.129, P=0.013). The average treatment course for HBeAgnegative patients with HBsAg loss was 70.2±48.0 weeks, shorter than that of HBeAg-positive patients with HBsAg loss (81.3±39.4 weeks), but no significant difference (t=-0.522, P = 0.602) found between. Conclusion Higher rate of HBsAg loss and seroconversion could be obtained by individual extended treatment courses in patients with rapid HBV DNA and HBsAg response to PEG-IFN α -2a treatment and the HBeAgnegative patients could got higher rate of HBsAg loss than HBeAg-positive patients.     

HepG2肝癌细胞中干扰素-α对抑癌基因Diekkopf-1上调表达的研究

目的探讨重组干扰素-α（IFN-α）对肿瘤抑制作用的靶分子及可能作用机制。方法选用HepG2肝癌细胞系,分别应用1000U/ml、2000u／ml浓度的IFN-α作用于HepG2细胞,在药物作用6h、16h后应用RT-PCR;Dickkopf-1（DKK-1）方法分别检测各实验组DKK-1mRNA表达水平,Westernblot杂交法检测DKK．1蛋白表达水平。结果定量RT-PCR结果显示,IFN-α处理能增强DKK-1mRNA表达。2000U／mLIFN-α作用HepG2细胞16h组其DKK-1mRNA表达（0．00039±0．000057）高于处理6h组（0．000195±0．000021,t=6．994,P=-0．0022）以及1000U／mL作用16h组（0．000307±0．000012,t=2．876,P=0．0452）;Westernblot显示重组IFN．仪作用于I-lepG2细胞后,均能够导致细胞内DKK-1蛋白表达增强（P值均〈O．05）。结论IFN-α能够上调DKK-1表达,DKK-1可能是IFN-α作用的下游调节靶基因,这可能是IFN-α发挥抗肿瘤作用机制之一。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-CFP21融合蛋白克隆表达及全血IFN-γ的检测

目的构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值。方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得CFP21和CFP10-ESAT-6(CE)基因片段,分别连接到pMD18-T,并将两片段2次连接到表达载体pET21a(+)中,获得pET21a-CFP10-ESAT-6-CFP21重组质粒;经表达纯化和复性后,去除内毒素,利用酶联免疫吸附试验检测48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-γ的释放量。结果CE21经SDS-PAGE分析后相对分子质量为45,与预期大小一致。CE21融合蛋白全血标本IFN-γ的检测,结核组阳性率为72.9%,非结核疾病对照组和健康对照组阳性率分别为3.3%和3.1%。结论成功获得CE21融合蛋白,IFN-γ的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值。     

聚乙二醇干扰素α-2a对乙型肝炎病毒复制及肝纤维化指标的影响

目的 观察聚乙二醇干扰素α-2a对乙型肝炎患者病毒复制及肝纤维化的影响。方法治疗组30例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者予聚乙二醇干扰素α-2a 180μg皮下注射，每周1次。对照组42例患者予普通干扰素α-2a500万u皮下注射，隔日1次，疗程均为48周，治疗结束后再随访72周。荧光定量PCR检测HBVDNA，放射免疫法检测血清肝纤维化指标。治疗组有9例患者治疗前、后行肝组织活检。结果治疗结束时至治疗结束后72周，治疗组HBeAg和HBVDNA定量值均显著低于对照组；治疗结束和治疗结束后72周时，治疗组血清HBeAg转阴及转换率、HBVDNA转阴率分别为58．6％、51．7％、48．3％和51.7％、44．8％、41、4％，均显著高于对照组。治疗组有3例血清HBsAg转阴。且持续到治疗结束后72周。对照组无转阴者。治疗组9例患者治疗前肝组织中HBsAg及HBeAg分别有8例和6例阳性。治疗结束时分别为2例和3例；治疗前、后肝组织炎症分级、纤维化分期及胶原表达差异无统计学意义（均P〉0．05）。治疗结束时及结束后72周，治疗组血清HA、LN、ⅣC和Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）较治疗前显著改善，在治疗结束后72周时均显著低于对照组。结论聚乙二醇干扰素α-2a能持久有效地抑制HBV复制。改善血清肝纤维化指标。     

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16kD和38kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段两次连接到表达载体pET21a中,形成38kD-16kD(3816),16kD, 38kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。     

人干扰素-α基因转移、表达及其抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的研究人干扰素-α(hIFN-α)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒的作用.方法利用聚合酶链反应(PCR)技术和基因重组技术,体外扩增hIFN-α基因并构建重组表达hIFN-α基因的逆转录病毒表达载体(pDOR-IFN-α),用NIH 3T3细胞扩增法测定其假病毒颗粒滴度,用染料吸收法检测hIFN-α活性;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用固相放免法检测其上清HBsAg和HBeAg,用斑点杂交法结合计算机扫描检测其细胞HBV DNA密度.结果PCR克隆出648 bphIFN-α全基因;假病毒颗粒滴度为1×106CFU/ml;hIFN-α生物活性为239 IU/ml/1×106/48 h;对HBsAg的抑制率随培养时间(2、4、6和8 d)的延长而逐渐增高,抑制率分别为33%、55%、55%和62%,而对HBeAg的抑制则在转染后的第2天抑制率最高,以后随培养时间延长而逐渐下降,其抑制率分别为67.7%、40%、19.5%和25.3%.而对照组对HBsAg第2、4、6、8天的抑制率分别为0%、10.8%、0%和13%,对HBeAg的抑制率分别为0%、0%、0%和1.2%.而且对HBV DNA亦有明显的抑制作用,抑制率达66%;而对照组(空白载体)抑制作用不明显.结论hIFN-α基因可以成功地转移和表达,并有抑制HBV复制和表达的作用.     

慢性乙型肝炎肝组织α-肌动蛋白基因扩增及蛋白表达分析的临床意义

目的研究慢性乙型肝炎（CHB）肝活检组织α-肌动蛋白（α-SMA）的表达,探讨α-SMA在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用及意义。方法通过RT-PCR对CHB活检组织的α-SMA进行半定量,结合肝脏组织学和免疫组化,对CHB患者的肝组织α-SMA的表达进行分析。结果在基因水平上,轻度CHB患者α-SMA/β-actin为0.126±0.032,与中度（0.323±0.099,P=0.001）和重度（0.410±0.103,P=0.000）比较差异有统计学意义;但在CHB患者中,中度和重度比较差异无统计学意义（P=0.097）。免疫组化显示：在CHB肝组织,α-SMA主要与坏死性炎症反应有关,贮脂细胞和肝窦内皮细胞表达α-SMA较强。CHB轻度组（G1/G2）,α-SMA表达于坏死性炎症反应部位;CHB较重组（G3/G4）,则表达于坏死区及其相邻的肝实质表达明显增加,且Kuppfer细胞明显增多。结论 HBV慢性感染状态下,α-SMA的表达上调,可能参与了与肝脏患者的CHB病理过程。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A对干扰素α-2b诱导的信号传导和转录激活因子1磷酸化及核转移的影响

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对干扰素α-2b诱导的Janus激酶-信号传导和转录激活子（JAK—STAT）信号传导途径中STAT1磷酸化及核转移的影响。方法用表达HCVNS5A的质粒（pCNS5A）转染Huh7细胞，应用免疫细胞化学技术检测HCVNS5A的表达，用免疫荧光和Western blot方法检测HCVNS5A对干扰素α-2b诱导的STAT1磷酸化和核转移的影响。结果转染了pCNS5A的Huh7细胞质可见HCVNS5A蛋白的表达；以干扰素α-2b诱导30min后，STAT1磷酸化及核转移在转染了表达HCVNS5A的质粒组比转染空白载体pRC／CMV组及未转染组减少，而未转染组及转染空白载体pRC／CMV组间无明显差别。结论表达HCVNS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞；HCV NS5A减弱干扰素α-2b诱导的STAT1的磷酸化及核转移，提示NS5A影响干扰素α-2b的JAKSTAT信号传导途径可能是HCV干扰素抵抗的机制之一。