TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立

目的建立敏感、特异、定量Real-time PCR方法,用于恙虫病东方体的检测。方法根据恙虫病东方体56 kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TaqMan-MGB探针具有良好的特异性,建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μlPCR反应管中只要有26个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。结论建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于恙虫病东方体感染的快速检测。     

立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法.方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系（R2=0.996）,最低检测浓度为5拷贝/μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性.用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关.结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断.     

恙虫病东方体与莫氏立克次体双重实时荧光PCR检测方法建立及其在鼠类检测中的应用

目的建立一种基于TaqMan-MGB探针技术的双重实时荧光PCR检测方法,用于鼠类携带恙虫病东方体和莫氏立克次体的检测工作开展。方法依据恙虫病东方体56-kDa蛋白基因序列设计恙虫病东方体引物及Taqman-MGB探针,参照文献合成莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针,建立恙虫病东方体及莫氏立克次体双重实时荧光PCR检测方法。结果利用本文建立的双重实时荧光PCR检测方法对288份鼠肺脏组织样品进行检测,检测结果与普通PCR检测结果一致。结论本文建立的双重实时荧光PCR检测方法,具有较好的特异性、敏感性及重复性,满足国境口岸鼠类携带恙虫病东方体及莫氏立克次体的监测检测工作需要。     

粤北山区域恙虫病自然疫源地的研究

目的了解粤北山区域是否存在恙虫病自然疫源地。方法采用分子生物学诊断技术结合间接免疫荧光方法调查粤北山区发热人群、宿主动物感染状况;采用荧光定量PCR技术对粤北山区域恙虫病病人的标本检测Ot-Sta56kDa基因片段,对阳性标本进行基因分型和序列分析,并与巢式PCR检测结果相比较。结果在660份发热人群血清标本中有224份检测到恙虫病东方体,阳性率为33.94%;在55份鼠类脾脏组织标本中有10份黄毛鼠(R.lossea Swinboe)检测到恙虫病东方体,阳性率为18.18%,有2份褐家鼠(R.norvegicus Berkenhout)检测恙虫病东方体,阳性率为3.64%,各调查点之间无显著性差异(P>0.05)。经荧光定量PCR和巢式PCR鉴定为Gilliam型和Kawasaki型,间接免疫荧光法也诊断为恙虫病东方体Gilliam型。从病人、动物宿主、地里纤恙螨选取4株粤北代表株,其同源性为100%,与Kawasaki型的同源性为96.25%;另有3份阳性黄毛鼠标本的核苷酸序列与TA686型的同源性为78.5%。结论从宿主动物、媒介、分子水平上证实粤北山区域存在恙虫病自然疫源地。     

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的 采用新型TaqMan—MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因（ompB）序列设计引物和探针，以克隆的ompB基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI7900型）上建立实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Q）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．999）；与巢式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA，检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本，某些样本检测为阳性，而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA，可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。     

河南省信阳地区鼠类感染立克次体的调查

目的了解河南省信阳疫区鼠类中恙虫病东方体、斑点热及斑疹伤寒立克次体感染状况。方法采用巢式-聚合酶链反应(nested-PCR),对信阳市淮滨县捕获的家鼠肝、脾、肾、血液标本进行扩增恙虫病东方体、斑点热群及斑疹伤寒群立克次体热休克蛋白(groEL)基因并测序分析。采用间接免疫荧光方法(IFA)对家鼠血清标本进行斑疹伤寒病原体、恙虫病东方体特异抗体检测。结果共捕获鼠62只,其中内脏标本中检出恙虫病东方体10份(16．13％),斑疹伤寒立克次体5份(8．06％),斑点热群立克次体4份(6．45％);血液标本中检出恙虫病东方体5份(8．06％),斑疹伤寒群立克次体4份(6．45％),斑点热群立克次体1份(1．61％)。有5份标本同时检出恙虫病和斑疹伤寒,复合感染率为8．06％。在鼠内脏标本中检测到2株蚤传斑点热病原体R．felis。用IFA检测26份鼠血清抗体,3份恙虫病阳性(11．5％)。结论信阳地区啮齿动物宿主鼠类标本中检测出恙虫病东方体、斑点热群和斑疹伤寒群立克次体,存在复合带菌状况,鼠血清恙虫病东方体特异抗体流行率较高。     

实时荧光定量PCR检测汉赛巴通体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测汉赛巴通体的实时荧光定量PCR方法。方法根据汉赛巴通体特异的16S-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的16S～23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900HT)上建立实时荧光定量检测方法,对所建立的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析,并且对模拟标本进行检测。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(C_(?))与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其1000倍。用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本,除军团菌检出微弱信号(2个拷贝)外,其余检出结果均为0;对重复性进行了评价,批内和批间的变异系数在0.2%～1.9%之间。用荧光定量PCR检测汉赛巴通体感染的小鼠血标本,在感染后第2天、第3天、第5天,检出少量的汉赛巴通体,在感染后的第1天和第2天从脾脏样本中检出大量的汉赛巴通体。结论检测汉赛巴通体实时荧光定量PCR方法具有高度特异性和高敏感性以及良好的重复性,可用于快速检测各种样本中的微量汉赛巴通体以及作为汉赛巴通体感染的实验室诊断。     

海南省2009年-2011年发热病人立克次体病检测及结果分析

目的分析海南省2009年-2011年不明原因发热病人中立克次体的感染状况及基因型别,探讨其防制对策。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省不明原因发热病人血液标本立克次体gro EL基因的特异性片段,并对阳性结果进行序列测定及聚类分析。结果 236份病人标本中27份gro EL阳性,阳性率为11.4%。阳性PCR产物测序并聚类分析结果显示,恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体同源性高;斑点热群立克次体和Rickettsia sibirica(AY059014)等11株斑点热群立克次体同源性较接近,而与2007年在澄迈县1例病人血标本中分离到Rickettsia sp Hainan 1(gb|EU402925)斑点热立克次体比较同源性较低;斑疹伤寒群立克次体和Rickettsia typhi str.B9991CWPP(CP003398)斑疹伤寒群立克次体共处于同一分支,同源性为100%。结论海南省不明原因发热病人中持续存在斑点热、斑疹伤寒和恙虫病感染的现象,应加强立克次体病的疾病监测和实验室检测能力。     

应用荧光定量PCR检测阴道加特纳菌

目的:确定荧光定量PCR方法检测细菌性阴道病相关细菌阴道加特纳菌的可行性。方法:采用SYBR Green方法建立了阴道加特纳菌荧光定量PCR方法,评价荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性;并对568例临床分泌物样本进行检测。结果:本实验所建立的荧光定量PCR方法可准确、特异的检测阴道加特纳菌;该方法的灵敏度可达到1拷贝/μl;194例细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出116例(59.79%)阴道加特纳菌;而在374例非细菌性阴道病患者分泌物标本中荧光定量PCR法检出35例(9.36%)阴道加特纳菌;荧光定量PCR法检出率明显高于细菌培养方法,差异具有显著性,χ2=24.89,P<0.01。结论:荧光定量PCR方法能够应该用于临床分泌物标本中的阴道加特纳菌的检测。     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

新疆博乐地区大沙土鼠感染恙虫病东方体基因分型与序列分析

目的 鉴定新疆博乐地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列.方法 应用巢式PCR(nPCR)对新疆博乐地区采集的鼠标本Ot-Sta56KDa基因片段进行检测,PCR扩增产物纯化后测序,进行序列分析.结果 博乐地区艾比湖滩涂地优势鼠种为大沙土鼠;在大沙土鼠脾总DNA用群引物扩增出481～507bp的目的 片段;经相应型引物扩增出了目的 片段,序列同源性显示,核苷酸序列与Karp、ISS-11、Taiwan的核苷酸序列的同源性为97%,与Kanda的核苷酸序列同源性为92%.系统发生树表明,分离株与Karp株亲缘关系较近.结论 在新疆地区首次从大沙土鼠中分离并扩增到恙虫病东方体基因片段,与Karp株型有较近的亲缘关系.     

我国恙虫病媒介恙螨的依据与鉴定

恙螨是恙虫病唯一的传播媒介。通常确定为恙虫病的媒介恙螨应具有4项标准:①流行病学证据;②有恙虫病东方体(Ot)的自然感染;③能经叮刺传播Ot;④能经卵传递Ot。我国已报告6种媒介恙螨,在分类上均归于纤恙螨属(Genus Leptotrombidium),即:地里纤恙螨、微红纤恙螨、吉首纤恙螨、高湖纤恙螨、海岛纤恙螨和小盾纤恙螨。此外,尚有10种可疑的媒介恙螨。本文介绍这些媒介恙螨的依据与鉴定。     

云南省保山市一起地方性斑疹伤寒暴发的调查

目的 了解云南省保山市一起地方性斑疹伤寒暴发的流行病学特征.方法 收集患者的流行病学资料.应用外斐反应和间接免疫荧光方法同时检测患者血清中莫氏立克次体、恙虫病东方体IgG抗体.用PCR检测鼠类脾脏标本中莫氏立克次体、普氏立克次体gltA基因,恙虫病东方体56kDa蛋白基因,斑点热群立克次体ompA基因,埃立克体16S rRNA基因和无形体16SrRNA基因.结果 2009年7-8月保山市隆阳区该起地方性斑疹伤寒累计发病58例,其中48例为临床诊断病例,10例为实验室诊断病例.3例地方性斑疹伤寒实验室诊断病例存在Karp型恙虫病东方体感染.PCR检测黄胸鼠脾脏85份,其中莫氏立克次体gltA片段阳性3份(阳性率为3.5%),其序列与莫氏立克次体Wilmington株(GenBank U59714.1)同源性为100%;普氏立克次体、恙虫病东方体、斑点热群立克次体、无形体和埃立克体均为阴性.结论 经流行病学、临床资料和实验室检测证实,保山市隆阳区该起疫情为地方性斑疹伤寒.从当地优势鼠种黄胸鼠中检测到莫氏立克次体核酸及序列,表明当地存在地方性斑疹伤寒疫源地.

Abstract：

Objective To understand the epidemiologic characteristics of endemic typhus in Baoshan city. Methods Epidemiological data were collected and characteristics were analyzed. IgG antibody(Ab) of Rickettsia mooseri and Orientia tsutsuganushi in serum of patients were tested using both Weil-Felix and IFA method. The Rickettsia mooseri gltA gene, Rickettsia prowazekii gltA gene,Orientia tsutsugamushi 56 kDa protein gene, SFGR ompA gene, Ehrlichia sp. 16S rRNA gene and Anaplasma sp. 16S rRNA gene in spleen of mice were examined by PCR. Results Fifty- eight endemic typhus cases were found in Longyang district of Baoshan city, during July to August, 2009.Among them, 48 cases were confirmed by clinical diagnosis and 10 cases by laboratory tests. The Ab of Orientia tsutsugamushi Karp serotype was detected in 3 cases from laboratory diagnosis. The spleen samples from 85 Rattns flavipectus were tested using PCR. Of them, 3 samples for Rickettsia mooseri gltA gene showed positive (positive rate was 3.5% ), and the homology of 3 Rickettsia mooseri and Rickettsia mooseri Wilmington strain (GenBank U59714.1) was 100% through comparing gene sequence. The results of PCR for detecting Rickettsia prowazekii, Orientia tsutsugamushi, SFGR,Anaplasma sp. and Ehrlichia. sp were all negative. Conclusion The outbreak of endemic typhus was confirmed in Longyang district of Baoshan city through epidemiological data, clinical diagnosis and laboratory tests. Rickettsia mooseri DNA was detected in the dominant Raw flavipectus, suggesting that endemic typhus did exist in the local areas.     

Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi by loop-isothermal DNA amplification

We present a loop-mediated isothermal PCR assay (LAMP) targeting the groEL gene, which encodes the 60kDa heat shock protein of Orientia tsutsugamushi. Evaluation included testing of 63 samples of contemporary in vitro isolates, buffy coats and whole blood samples from patients with fever. Detection limits for LAMP were assessed by serial dilutions and quantitation by real-time PCR assay based on the same target gene: three copies/microl for linearized plasmids, 26 copies/microl for VERO cell culture isolates, 14 copies/microl for full blood samples and 41 copies/microl for clinical buffy coats. Based on a limited sample number, the LAMP assay is comparable in sensitivity with conventional nested PCR (56kDa gene), with limits of detection well below the range of known admission bacterial loads of patients with scrub typhus. This inexpensive method requires no sophisticated equipment or sample preparation, and may prove useful as a diagnostic assay in financially poor settings; however, it requires further prospective validation in the field setting.     

首次实验室证实北京平谷地区恙虫病东方体暴发流行

目的了解北京市平谷地区是否存在恙虫病东方体感染。方法采用巢式聚合酶链反应（nPCR）,对平谷地区采集的30份临床标本进行恙虫病东方体热休克蛋白（groEL）基因和56×103蛋白扩增并测序分析。采用间接免疫荧光试验（IFA）对血清标本恙虫病东方体特异抗体检测。结果采用PCR共检测血液标本30份,均阳性（100%）;用IFA检测28份患者血清抗体,25份阳性（89.3%）;长片段PCR扩增,3份标本扩增阳性,阳性结果测序比对所有核苷酸序列相同,与Kawasaki的同源性为96%。结论首次从分子流行病学和血清流行病学的角度证实北京平谷地区存在恙虫病东方体。     

山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析

目的鉴定山东地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列。方法以日本、韩国常用的恙虫病东方体分型引物,用巢式PCR技术检测恙虫病东方体分离株的相对分子质量(Mr)56×103蛋白基因片段,对群引物扩增的PCR产物纯化回收后测序,并行序列分析。结果Gilliam、Karp、Kato、山东分离株用群引物均扩增出481-507 bp的目的片段,Gilliam、Karp、Kato经相应的型引物扩增出了目的片段。山东分离株仅Kawasaki型的分型引物扩增出目的条带,序列分析证实山东分离株与Kawasaki型相似。结论在国内首次扩增出Gilliam、Karp、Kato三型标准株,山东地区恙虫病东方体分离株为Kawasaki型;山东地区恙虫病东方体与日本的Kawasaki型相似,两者有较近的亲缘关系。     

高湖纤恙螨叮刺和经卵传递恙虫病东方体的研究(英文)

目的研究高湖纤恙螨叮刺和传播恙虫病东方体(Ot)的能力。方法螨叮人传病试验是将2只未食高湖纤恙螨幼虫放在受试者(笔者本人)的前臂屈侧上,罩上透明塑料小盖,在解剖镜下观察螨的活动。经卵传递Ot试验是将20～40只高湖纤恙螨未食幼虫放在1只小白鼠耳中3～5 d,每天观察鼠的情况,病鼠或死鼠予以解剖,镜检Ot。结果恙螨叮人20 d后使人患恙虫病并从血中分离到Ot。鼠体经卵传递Ot试验亦获得成功。阳性鼠均有典型症状、显著病变,并检出Ot。结论结果表明高湖纤恙螨可作为恙虫病的传播媒介。     

山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查

目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体（Ot）情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性.方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定.结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带.对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份（LHGM2株）为Karp型.序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果：XDM2株首轮PCR产物碱基序列与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97.00%,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型;LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96.45%,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型.结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型.