人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

人内皮细胞一氧化氮合酶红色荧光蛋白报告基因载体的构建与表达

目的：研究血管壁切应力诱导的人血管内皮细胞内皮细胞-氧化氮合酶（eNOS）基因表达的调控机制,构建在哺乳动物细胞中表达的eNOS红色荧光蛋白报告基因载体。方法：从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子,将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRedl-l上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后将重组载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达和分布情况。结果：PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDseNOSRed的构建正确,该载体能在293细胞中高效表达。由eNOS启动子驱动表达的红色荧光蛋白大部分均匀分布于整个细胞中,转染后12h开始出现,36-48h为表达高峰,120h后红色荧光几乎全部消失。结论：成功构建了eNOS红色荧光蛋白报告基因载体,该载体能在哺乳动物细胞中高效表达,为研究血管壁切应力诱导血管内皮细胞eNOS基因表达的调控机制提供了一个重要而又方便的工具。     

S100A8启动子的克隆及转录活性检测

目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础.     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的：构建IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体，为研究细胞内IPl0的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法：采用基因重组技术构建含IPl0启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-IPl0；用脂质体瞬时转染HEK293细胞，观察IPl0启动子对脂多糖（LPS）刺激的反应。结果：酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的；该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低，经LPS刺激后，在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论：所构建的IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的，对生理相关刺激有很好的反应，可有效地用于IPl0基因表达信号调控机制的研究。     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

S100A8启动子的克隆及转录活性的检测

目的 构建小鼠S100 A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖（LPS）、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性。方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达。结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加。结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础。     

RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达

目的 构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用.方法 利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可凋控载体pRSl7.RUDsRed.在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达.结果 PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性.没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达.结论 成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的 基凶表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础.     

α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

目的构建α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子（TGF-β1）刺激的反应。结果酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1,刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

神经干细胞特异性调控启动子研究

目的 研究神经干细胞特异性调控启动子。方法 PCR扩增出小鼠nestin基因启动子全序列(4000bp)、核心序列(400bp)和内含子 2;以pcDNA3.1为模板,构建6种重组质粒,分别用CMV、CMV+内含子-2、nestin基因启动子全序列、nestin基因启动子全序列+内含子 2、nestin基因启动子核心序列、nestin基因启动子核心序列+内含子-2作为启动子调控报告基因EGFP表达;6种重组质粒分别转染nestin+、nestin-细胞,荧光显微镜下观察转染后细胞内EGFP表达,同时采用流式细胞仪法测定表达EGFP细胞表达率。结果 nestin基因启动子全序列及核心序列都能非特异性调控EGFP基因在细胞内表达,并且具有较强调控能力,与内含子-2融合后,只能特异性调控EGFP基因在nestin+细胞表达,而CMV启动子与内含子-2序列融合只具有非特异性调控能力。结论 nestin基因启动子全序列与内含子-2协同调控外源基因在nestin+细胞特异性表达。     

人CAT启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

目的 构建人过氧化氧酶(CAT)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为进一步研究CAT表达调控奠定基础.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR获得-404～+16大小的肩动子片段,将其定向插入pDsRed1-1载体,构建pDsRed-CATp红色荧光蛋白报告基因载体.瞬时转染NIH/3T3细胞,观察CAT启动子对H_2O_2刺激的反应.结果 pDsRed-CATp经双酶切及DNA测序分析鉴定准确无误;该载体瞬时转染N1H/3T3细胞,静息状态呈现弱转录,H_2O_2刺激后,转录水平明显增强.结论 成功构建CAT启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,对H_2O_2刺激反应良好,为研究CAT基因表达调控提供了有效的工具.

Abstract：

Objective To construct a red fluorescent protein reporter gene driven by human catalase gene promoter. Methods The red fluorescent protein reporter gene plasmid pDsRed-CATp containing human catalase gene promoter was constructed by gene recombination technique. The plasmid was transiently transfected into NIH/3T3 cells to observe their response to H_2O_2 stimulation. Results The plasmid was constructed correctly as verified by double enzyme digestion and sequence analysis. The plasmid was lowly expressed in resting NIH/3T3 cells, but the expression level increased obviously after stimulation by H_2O_2. Conclusions A red fluorescent protein reporter gene plasmid driven by human catalase gene promoter has been constructed successfully with a sensitive response to H_2O_2 stimulation. This system provides a convenient tool for the study of the regulatory mechanism of catalase gene expression.     

绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共转染骨髓间充质干细胞、乳鼠心肌细胞、Eahy926细胞表达特征的共聚焦分析

目的利用携带绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)报告基因的慢病毒载体共转染,观察2种报告基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)、乳鼠心肌细胞(Myo)和内皮细胞株(Eahy926)中的整合表达特征。方法应用人类1型免疫缺陷病毒改造而构建慢病毒载体,将GFP、RFP以同时或先后方式共转染hMSC、乳鼠Myo和Eahy926细胞,激光共聚焦显微镜观察2种报告基因在不同细胞中的共表达特点。结果 3种细胞均能被GFP、RFP共转染,其中hMSC和乳鼠Myo均有竞争加随机转染方式,Eahy926只有随机转染方式;3种细胞转染GFP、RFP的效率有所不同,共表达2种报告基因的细胞表现为以核为中心的表达区域重叠。结论 hMSC、乳鼠Myo和Eahy926细胞均可共转染2种报告基因,但整合方式有所不同,这将对利用多个报告基因同时示踪细胞多种生命特征提供有力帮助。     

一种检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株的构建

目的：构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株。方法： 首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子“外排泵”基因 copA 的启动子融合构建响应铜离子的 CopAp::gfpmut2 -pET28a感应元件。然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌（ E .c o l i ）MC4100体内 负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建。最后优化出最佳检测条件, 并将其初步应用于检测水环境中铜离子。结果：相对野生型菌株, E .c o l iΔ cusA -Δ copA -Δ cueO 突变菌对铜 离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依 赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05～2.5μmol/L（0.0032～0.16mg/L）Cu2+;与原子吸收光谱法相 比,其对生活饮用水中0.05mg/L和1mg/L铜离子的回收率分别为87.90%和104.37%。结论：本研究构建报 告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定 了技术基础。     

miR-210靶基因HBVSP2的鉴定

目的：构建miR-210的过表达载体,利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-210的靶基因HBVSP2。方法：构建含有miR-210前体序列的miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210;选取表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒 pcDNA3/EGFP,将miR-210在HBVSP2上靶位点的一段特异性序列插入该质粒中,构建EGFP报告载体pcDNA3/EGFP-HBVSP2,并与miR-210ASO或者pcDNA3.1(+)/pri-miR-210及表达红色荧光蛋白质(RFP)的pDsRed2 -N1共同转染HEK293以及HepG2 2215细胞,用荧光分光光度计定量检测转染后提取的蛋白样品的荧光值。结果：共同转染pcDNA3/pri-miR-210 和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2质粒后,EGFP/RFP的表达量明显低于pcDNA3和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组(P<0.05)。共转染miR-210ASO和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP的表达量高于共转染LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于LacZ和pcDNA3/EGFP组(P<0.05)。结论：成功构建miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210和含有miR-210靶位点的pcDNA3/ EGFP-HBVSP2,HBVSP2 可能是miR-210的直接靶基因。     

p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中的表达的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）红色荧光蛋白（RFP）融合表达载体。方法 将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上，随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察。结果 结果 重组质粒经酶切，PCR和测序证明正确无误，并在HeLa细胞中得到高量表达，融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中，细胞核中也有一定的分布。结论 成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体。该载体能在哺乳动物细胞中进行表达，为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。     

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.