MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性。方法将pcDNA3．1-MXA重组质粒和PU19-1．24HBV重组质粒分别按1：1、2：1共转染HepG2细胞（MXA组），对照组使用空pcDNA3．1、Salon DNA和PU19-1．24HBV重组质粒共转染，3d后Western blot检测MXA蛋白表达，Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量，定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平，统计学分析结果。pcDNA3．1-MXA与PU19-1．24HBV重组质粒共转染HepG2细胞，对照组为pcDNA3．1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染．3d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达。结果Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达：与对照组相比，pcDNA3．1-MXA和PU19—1．24HBV重组质粒按1：1转染时，MXA组HBeAg下降27％．上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0．6个log值；按2：1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66％，上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1．9个和1．7个log值，差异均具有统计学意义（P〈0．05）。Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别。结论MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性，抑制活性与蛋白的表达量相关；在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解。     

α干扰素于体外培养的2.2.15细胞中对MxA基因的诱导及抗HBV作用

干扰素(IFN)诱导性抗病毒基因MxA于细胞内具有直接的抗RNA类病毒复制作用，已得以广泛验证。对DNA病毒的影响亦倍受关注。我们以2．2．15细胞培养为基础，通过IFN的刺激，观察IFN体外抗HBV复制及MxA基因的表达变化，以阐明MxA蛋白在IFN抗HBV复制中的作用。     

注射用免疫核糖核酸II的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

 目的 研究干扰素刺激基因因子3（ISGF3）在干扰素α（IFN-α）抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制机制中的作用。 方法 应用定量PCR技术检测IFN-α处理前后人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞上清HBV DNA含量，DNA印迹法检测IFN-α处理前后HepG2.2.15细胞内HBV复制中间体的变化，蛋白质印迹法检测IFN-α处理前后HepG2和HepG2.2.15细胞中ISGF3的3个组分即信号转导和转录活化因子（STAT）1、磷酸化STAT2和ISGF3γ以及双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)蛋白质表达水平的改变。用酪氨酸酶抑制剂染料木黄酮抑制IFN-α作用后，再次进行上述检测。 结果 IFN-α处理后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和细胞内HBV复制中间体减少，HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达水平均升高。加染料木黄酮抑制IFN-α后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和复制中间体无减少，而HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达均减少。 结论 ISGF3是IFN-α抑制HBV复制的关键因子。     

preS2反义RNA肝癌特异性表达载体的构建及相关特性研究

目的 构建针对preS2基因的肝癌特异性反义RNA表达载体，并对其特异性和有效性进行研究。方法 PCR扩增preS2(3203—340)基因，克隆至含甲胎蛋白启动子的EB病毒表达载体pEBAF，构建反义RNA表达载体pEBAF-as—preS2。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，3d后Northern blot检测preS2 mRNA的表达，ELISA检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果序列分析表明，pEBAF-as-preS2构建成功，Northern blot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达，pEBAF-as-preS2转染3d后，可显著抑制HepG2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别为33．4％和41．5％；对HBV复制抑制率为86％。结论 反义RNA表达载体pEBAF-as-preS2仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

霉酚酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

目的:探讨霉酚酸（MPA）在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。 方法:将不同浓度的MPA（1-20 mg/L）作用于HepG2.2.15细胞，在外加或不加鸟嘌呤核苷（简称鸟苷）的情况下，分别收集第4 d细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg），采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测细胞内乙型肝炎病毒核心蛋白mRNA（HBV core mRNA）,狭缝印迹杂交法定量分析细胞内 HBV DNA。 结果:在不外加鸟苷情况下，MPA对HBV复制具有抑制作用，随着浓度增加，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBV DNA复制水平下降。外加鸟苷后能逆转MPA对HBV复制的抑制作用。 结论:MPA对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌及HBV DNA复制具有抑制作用。MPA可能通过减少细胞内鸟苷酸的合成来实现对HBV复制的抑制。     

APOBEC3F的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的克隆、体外真核表达载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)基因并研究其抗病毒效应。方法应用RT-PCR的方法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3F基因,构建HA-APOBEC3F融合蛋白真核表达载体pXFA3F,pXFA3F和具有复制能力的1.3倍HBV载体pHBV1.3共转染HepG2细胞,Western印迹检测APOBEC3F融合蛋白在HepG2细胞中的表达,ELISA方法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果克隆了APOBEC3F基因,其经测序与GeneBank公布序列一致;构建的APOBEC3F真核表达载体pXFA3F经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;APOBEC3F可抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,可使转染细胞内HBV相关mRNA水平下降。结论成功克隆并真核表达了APOBEC3F基因,其在体外具有抗HBV生物学效应。     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

SAMHD1 对HBV DNA 形成的抑制作用及其机制研究

目的:研究不同肝细胞SAMHD1 表达水平及其对HBV DNA 形成的抑制作用和相关机制。方法:通过实时荧光定量PCR 和Western blot 法检测Jurkat、THP-1、HepG2、HepG2.2.15 和Huh7 细胞等细胞SAMHD1 mRNA 和蛋白表达水平;通过对HepG2.2.15 细胞转染过表达质粒和shRNA,升高或者降低SAMHD1 的表达水平,观察不同SAMHD1 表达水平对HBV DNA 水平的影响;补充不同浓度的dNTP,比较不同dNTP 浓度对HBV DNA 水平的影响。结果:肝癌细胞系有较高的SAMHD1表达水平;降低SAMHD1 可以使HBV DNA 水平升高2.3 ~ 2.8 倍,升高SAMHD1 可以使HBV DNA 降低至33% 左右(P<0.01);升高dNTP 浓度可以促进HBV DNA 的合成水平,抵消SAMHD1 的抑制作用。结论:SAMHD1 可以抑制肝癌细胞内HBV DNA 的生成,可能是通过降低细胞内dNTP 浓度实现的。     

HBV感染HepG2细胞早期过程研究

目的 探讨HBV吸附穿入HepG2细胞的方式，明确HBV难以自然感染细胞系的受限因素，为建立HBV自然感染细胞模型奠定基础。方法 在4℃和37℃条件下，HBV吸附HepG2细胞，用PCR方法检测胰酶消化液和细胞内的病毒DNA。另一部分HepG2细胞经过低温同步化处理，接种HBV后，于不同时相分别收集细胞和培养上清液，其中部分细胞进行核浆分离，通过问接免疫荧光、ELISA和PCR方法分别检测其中的病毒抗原和DNA，并且通过选择性PCR检测HepG2细胞HBV cccDNA。结果 在4℃条件下，HBV只是吸附于HepG2细胞膜表面。37℃条件下，部分吸附于HepG2细胞表面的病毒颗粒发生穿人，进入细胞浆，HepG2细胞和胰酶溶液中均可检出HBV DNA。接种病毒后4h、8h、24h HepG2细胞HBV DNA均呈阳性，至48h转为弱阳性，而96h为阴性。各时相上清液HBV DNA和病毒抗原均为阴性。HBV穿入HepG2细胞后，首先主要分布于胞浆中，随后出现胞核聚集性，胞浆中的病毒逐渐减少直至消失(感染后24h)，而胞核中的病毒数量早期逐渐增加，从48h开始呈下降趋势，至96h消失。病毒接种后8h核膜与核浆中均可检出病毒DNA。各时相cccDNA检测始终阴性。结论 HBV可能以“共受体”模式感染靶细胞。病毒脱衣壳过程受阻可能是HepG2细胞不支持HBV复制型感染的主要受限因素。     

设计特异性识别HBV核心启动子的锌指蛋白以抑制HepG2.2.15细胞中HBV的转录

目的:设计特异性结合乙肝病毒核心启动子(HBVCp)的锌指蛋白(ZFP),观察ZFP在体外对HBV转录的抑制情况。方法:利用Zinc finger tools设计特异性结合HBV Cp的ZFP。将ZFP核苷酸序列人工合成后克隆至pEGFP-N1和pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pEGFP-N1/ZFP-Flag和pcDNA3.1(+)/ZFP。通过倒置荧光显微镜、RT-PCR和Western blot鉴定pEGFP-N1/ZFP-Flag在COS-7中的表达情况;将pcDNA3.1(+)/ZFP转入HepG2.2.15细胞后24 h,采用ELISA和FQ-PCR检测上清液中HBeAg和HBV DNA含量,RT-PCR检测细胞内HBV mRNA水平。结果:ZFP在COS-7细胞中能正常表达。与空质粒组相比,ZFP组细胞培养上清液中HBV DNA拷贝量和HBeAg含量明显降低(P<0.05),细胞内HBV mRNA也显著减少。结论:人工设计的ZFP可以在真核细胞内正常表达,并能有效抑制HBV的转录。     

肝细胞癌组织中转化生长因子α表达及其与乙型肝炎病毒感染的 …

目的 研究肝细胞（ＨＣＣ）中转化生长因子α（ＴＧＦα）的表达及其与ＨＢＶ感染的关系。方法 应用原位杂交及免疫组化ＳＰ法对５３例ＨＣＣ及１４例正常肝组织吕ＴＧＦαｍＲＮＡ、ＴＧＦα蛋白、ＨＢＶ ＤＮＡ进行检测。结果 ５３例ＨＣＣ组织中ＴＧＦαｍＲＮＡ、ＴＧＦα蛋白的阳性率分别为３０．２％（１６例）、７３．６％（３９例）,显著高于无表达的正常对照组（Ｐ〈０．０５）。癌旁不典型增生肝细胞组ＴＧＦαｍＲＮ     

原蛋白转化酶在转化生长因子β_1抑制HBV复制效应中的作用

目的:探讨原蛋白转化酶(PCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)抑制HBV复制效应中的作用。方法:常规培养的HepG2.2.15细胞加2μg/L或5μg/L重组TGFβ1或/和20μmol/L PC抑制剂作用18h,收集细胞提取细胞总RNA和HBV衣壳DNA,采用荧光定量PCR技术检测PC mRNA和HBV DNA含量。结果:HepG2.2.15细胞的7种PCs均有不同程度的表达。加用重组TGFβ1后除PC5/6下调外,其余PCs均显著上调。尽管PC1/3和PC2上调最显著,但结合基础表达水平的分析显示furin和PACE4在TGFβ1处理前后均为优势表达PCs。在HepG2.2.15细胞上,进一步使用PC抑制剂可消除TGFβ1抑制HBV复制的效应。结论:上调PCs mRNA表达是TGFβ1抑制HBV复制的重要中间环节。此结果对进一步探讨TGFβ1有效干预HBV复制具有积极意义。     

MAP30苦瓜抗HIV蛋白对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的：研究MT为3000的苦瓜抗HIV蛋白(MAP30)对2．2．15细胞内HBV基因表达的抑制作用。方法：将HBV DNA转染的人肝癌细胞株2．2．15，在MAP30存在的情况下培养后，进行间接免疫荧光染色，用共聚焦技术定量分析细胞内HBeAg的表达。结果：与对照组相比较，MAP30培养的细胞内HBeAg荧光量明显减少。结论：MAP30对2．2．15细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用。     

ISGF3:IFN-α抗乙型肝炎病毒信号转导机制的重要因子

目的　研究干扰素 α(IFN α)抗乙型肝炎病毒(HBV)的信号转导机制。方法　用定量聚合酶链反应(PCR)检测IFNα2b处理前、后的HepG2 2 15细胞上清的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)水平。半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测IFNα2b处理后不同时点的HepG2 2 15细胞和其母源细胞HepG2 细胞内信号转导和转录活化因子1(STAT1)、STAT2、干扰素刺激基因因子3γ(ISGF3γ)、2′5′寡腺苷酸合成酶(2′5′OAS)、RAN依赖蛋白激酶(PKR)的mRNA表达水平。WesternBlot检测ISGF3γ的蛋白质表达水平。并用染料木黄酮阻断IFNα2b信号转导后再次检测上述指标。结果　IFNα2b处理8h后,HepG2 2 15细胞上清HBVDNA平均减少0 72log 10copies ml,而加染料木黄酮后则无减少。IFNα2b处理后,HepG2 和HepG2 2 15细胞中STAT1、STAT2、ISGF3γ、2′5′OAS和PKRmRNA水平明显升高;加染料木黄酮后前3个因子mRNA水平仍然能检测到,而2′5′OAS和PKRmRNA则受到抑制。WesternBlot检测也提示IFNα2b处理后ISGF3γ蛋白质水平升高,加染料木黄酮后其表达受到抑制。结论　Janus酪氨酸激酶(JAK) STAT途径在IFN α抗HBV中发挥主要作用,而ISGF3是该途径的一个重要因子。     

肝脏内源性microRNA调控乙型肝炎病毒基因的表达与复制

目的探讨肝脏内源性microRNA对乙型肝炎病毒(HBV)复制与基因表达的影响。方法通过miRNA靶点分析软件寻找与HBV序列之间相关联的肝脏内源性microRNA,体外化学合成相应的microRNA分子,将合成寡核苷酸及对照与1.3倍HBV全基因组真核表达质粒pUC18-HBV1.3采用Lipofectamine2000共转染HepG2细胞,转染48h后收集细胞培养上清;通过ELISA检测HBsAg、HBeAg的表达水平;Western印迹检测HBcAg的表达水平;Trizol抽提转染细胞RNA,逆转录后用荧光定量PCR检测HBVmRNA的水平;提取细胞基因组DNA,Southern印迹检测HBV的复制中间体。经以上检测从HBV蛋白表达、转录和复制水平评价相应的microRNA作用效应。结果生物信息学方法提示miR-16和miR-122存在与HBV基因组作用的可能结合位点。经试验初步证实miR-16可下调HBV蛋白的表达及HBVDNA水平;miR-122可下调HBsAg、HBeAg的表达,上调HBVmRNA的水平。结论肝脏内源性microRNA可以调节HBV的复制与基因表达。     

HBV体外感染卵巢颗粒细胞

目的建立HBV体外感染颗粒细胞模型,研究HBV在颗粒细胞中的复制情况,为深入研究HBV经卵细胞母婴垂直传播提供研究平台。方法原代颗粒细胞体外培养后用HBV阳性血清感染。收集培养上清,在不同时点检测HBsAg、HBeAg定量,实时定量PCR检测HBVDNA。免疫组化检测培养细胞中的HBsAg和HBcAg。巢式PCR检测细胞中的HBVDNA及HBV-mRNA。原位杂交检测细胞内的HBVDNA。结果成功建立了HBV体外感染颗粒细胞模型,在培养上清中可以持续96h检测到HBsAg和HBV DNA,在细胞内检测到HBsAg和HBcAg的阳性信号,PCR扩增显示细胞内有HBVD-NA及HBV-mRNA的存在,原位杂交证实细胞内HBVDNA阳性。结论 HBV能够在体外感染颗粒细胞,并在其内复制,该结果为深入研究HBV经卵细胞传播机制提供了很好的研究平台。     

热休克蛋白70对HBV复制的影响

目的:探讨过表达热休克蛋白70(HSP70)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法:运用RTq PCR检测HBV复制对HSP70表达的影响及过表达HSP70对HBV 3.5 kb m RNA的影响;运用Western blot法验证HSP70过表达效果及过表达HSP70对HBV核心蛋白的影响;RT-q PCR和Southern blot法分析过表达HSP70对HBV复制中间体的影响;运用双萤光素酶报告系统检测过表达HSP70对HBV启动子活性的影响。结果:HBV复制显著抑制HSP70的m RNA水平。过表达HSP70抑制HBV复制中间体、3.5 kb m RNA以及核心蛋白的表达,同时抑制HBV核心启动子的活性。结论:HBV复制抑制HSP70的表达。过表达HSP70抑制HBV的复制。本研究结果表明,HSP70通过抑制核心启动子的活性抑制HBV的复制。