早熟凝集染色体技术在核事故应用中的方法学改进

目的 研究早熟凝集染色体(PCC)技术的方法学改进,为核和电离辐射事故时快速估算受照生物剂量提供良好的读片标本。方法 取人的肘静脉血,以常规的PCC培养方法为标准,通过对培养中加入化学诱导剂花萼海绵体诱癌素A(CA)、有丝分裂阻断剂秋水仙素来研究收获PCC的形态和长度;通过对制片方法的改进来增强收获的PCC形态达到良好的状态;加入苦杏仁苷和细胞松驰素B(Cyt-B)2种细胞增殖促进剂在⁶⁰Coγ射线大剂量照射的条件下,对促进周围血淋巴细胞增殖的作用。结果 ①以加入CA为35 nmol/L、秋水仙素30 nmol/L培养50 h后收获的PCC形态与结构最好,符合长度:宽度比例要求的细胞率最高(47.4%);②制片中增加低渗液的用量至8 ml和延长时间至30 min并在37℃水浴下进行,同时改变固定液的比例为2:1能增强收获良好的PCC标本;③照射0~20.0 Gy后,以质量浓度苦杏仁苷为150 mg/L和Cyt-B为0.2 mg/L共同培养收获的细胞增殖率最高,常规法培养最低。结论 本研究的方法学改进可快速获得良好的PCC读片标本,为核和电离辐射事故时快速估算受照的生物剂量提供方便。     

不同早熟凝集染色体方法对60Co γ射线照射的剂量-曲线影响的研究

目的 研究早熟凝集染色体(PCC)方法学的常规法和改进后的方法对⁶⁰Co γ射线剂量-效应曲线影响,为事故应急选择快速和准确的生物剂量估算方法。方法 取3名23~28岁的男性肘静脉血,在⁶⁰Co γ射线照射(0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 Gy,吸收剂量率0.635 Gy/min)的条件下,以常规PCC培养方法为对比;比较2种方法(常规法和改进法)的50 h和60 h的2个培养时间所产生剂量-效应曲线的关系;以另一实验室照射10.0 Gy(吸收剂量率0.670 Gy/min)所产生的PCC环结果,用上述制作的剂量-曲线估算剂量作验证。结果 ①常规50 h培养方法15.0、20.0 Gy点所获PCC细胞数不能满足统计学要求,常规方法60 h、改进法50和60 h的3个培养方法收获的细胞数均可满足统计学要求,故后3个方法均取作剂量曲线;②后3个培养方法的PCC环与受照剂量的相关系数其系数间相当接近(均0.996以上、均P < 0.01),直线回归方程成立,相关指数亦相当接近,剂量-效应拟合均为线性模式,回归系数间差异无统计学意义(P < 0.05),回归直线的形态基本重叠;③验证:本研究的3条剂量-曲线估算受照10.0 Gy的结果误差均 ≤ 8%,均符合生物学实验一般允许的15%。结论 本研究的3个方法制作的3条曲线均可用于大剂量电离辐射损伤的生物剂量估算,但以改进法的50 h培养速度快,可作为事故应急首选的方法。     

苦杏仁苷促进人血T淋巴细胞早熟凝集染色体增殖的实验研究

[目的]探讨苦杏仁苷促进入血T淋巴细胞早熟凝集染色体（PCC）分裂增殖的作用,为辐射损伤快速生物剂量估算提供依据。[方法]每一实验项目取6名不同实验者的周围血加入不同浓度的苦杏仁苷进行实验。姐妹染色单体互换（SCE）方法用于观察苦杏仁苷最佳增殖浓度和促进细胞进入下一分裂周期的作用,以第2代细胞率为指标;常规的PCC方法（培养48h）和本研究的PCC方法（培养40h、加不同浓度苦杏仁苷）用于观察PCC细胞的G1、S、G2和M期,以G2＋M期PCC细胞率作评价指标。[结果]①每一实验者苦杏仁苷均明显促进T淋巴细胞的增殖（P〈0．01-P〈0．005）,最佳浓度为每L培养体系含200mg苦杏仁苷,比0mg／L的第2代细胞率增加0．74～1．60倍。②以苦杏仁苷促进细胞增殖的最佳浓度培养体系,培养28h加入秋水仙素的时间点出现第2代细胞（5‰～9％。）;而未加苦杏仁苷的样本要在培养36h加秋水仙才出现第2代细胞（4‰-9‰）提早8h。③以苦杏仁苷最佳浓度配合花萼海绵体诱癌素A的培养体系培养,获得T淋巴细胞G2＋M期的PCC细胞率最高（68．5％±31．0％）;与0mg／L浓度组（26．8％±15．7％）及常规方法（38．17％±18．56％）比较,差异均有统计学意义（P〈0．01和P〈0．05）。[结论]苦杏仁苷有明显促进人血T淋巴细胞PCC增殖的作用;可缩短细胞分裂周期;对于辐射损伤应急生物剂量估算有重要的应用价值。     

3例辐射事故受照者CB微核分析及生物剂量估算

[目的] 对河南新乡一起60Co源辐射事故中3例受照者进行了CB微核分析,并对其生物剂量进行估算.3例受照者A、B、C均为男性,受照时年龄分别为31、39和51岁,分别受照后24 d、44 d和96 d采血培养,进行CB微核分析和剂量估算.[方法] CB微核标本的制备方法为对3例受照者分别取0.3～0.4 ml肝素抗凝静脉血,加到4 ml含20%小牛血清和50 μg/ml PHA的混合培养液中,置37℃恒温培养箱中培养,培养至40～44 h,加入终浓度为6 mg/L的松胞素B,继续培养至72 h收获.常规制片,Giemsa染色.显微镜下观察双核淋巴细胞,并记录其微核数.结果以微核细胞率(CBCMN,‰)和微核率(CBMN,‰)表示,并估算剂量.生物剂量估算采用白玉书教授等建立的60Co γ射线照射离体人血诱发的CB微核的剂量曲线估算生物剂量.[结果] 照后24 d 3例受照者的CB微核率和CB微核细胞率均明显升高,由此估算的剂量分别为①3例受照者依据CBMN率估算的个体辐射剂量分别为0.97 Gy(A)、0.74 Gy(B)和0.58 Gy(C);②依据CBCMN率估算的个体辐射剂量分别为0.87 Gy(A)、0.64 Gy(B)和0.50 Gy(C).[结论] 本文用CBMN估算剂量与染色体"双+环"畸变剂量和物理剂量接近,与放射损伤的临床诊断亦相符合.说明CB微核分析估算事故照射受照者的照射剂量是准确可行的.而且本调查中照后取血时间对CB微核剂量的影响分析发现,照后44 d和96 d,3例受照者CB微核率和由此估算的剂量均明显下降.与国内外许多起辐射事故病例观察的结果一致.     

60Co γ射线照射对体外培养的心肌细胞活性及凋亡的影响

目的研究60Co γ射线照射对体外培养的心肌细胞活性及凋亡的影响。方法体外培养新生大鼠心肌细胞,分为对照组和照射组,照射组细胞分别用60Co γ射线5Gy、10Gy、20Gy单剂量照射心肌细胞,照射后48h检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)浓度,流式细胞仪检测60Coγ射线照射对体外培养的心肌细胞凋亡的影响,照射后48h及120h用结晶紫试验及MTT试验检测照射后心肌细胞活性变化,结果照射组LDH浓度明显高于未照射组,且随照射剂量增加而升高。照射后48h凋亡细胞较对照组升高,凋亡细胞比例与照射剂量呈正相关。结晶紫试验及MTT试验均提示照射后48h照射组心肌细胞活细胞活性与对照组无明显差异,照射后120h照射组活细胞活性明显低于对照组,且与照射剂量相关。结论60Co γ射线单剂量照射可直接损伤心肌细胞,降低体外培养的心肌细胞活性,促进心肌细胞凋亡。     

Calyculin A诱导早熟染色体与低剂量电离辐射剂量-效应关系

目的 探讨CalyculinA诱导早熟染色体凝集技术作为低剂量电离辐射生物剂量计的可行性。方法 取健康成年人的抗凝外周静脉血,用X射线分别以0、0.1、0.25、0.5、0.75和1.0Gy照射。照射后将血样接种于RPMI1640培养基中,于37℃、5% CO₂恒温培养箱内培养48h,当培养24h时加入秋水仙素,终止培养前2h加入CalyculinA诱导早熟凝集染色体,收获制片并用Giemsa染液染色,观察G1、G2/M-PCC细胞中总畸变率、断片率、双着丝粒体加着丝粒环率与辐射剂量的效应关系。结果 用CalyculinA可成功诱导人外周血淋巴细胞产生PCC,且总畸变率、断片率、双着丝粒体加着丝粒环率随照射剂量的增加而增加,最佳拟合曲线为二次多项式模式。结论 CalyculinA诱导PCC技术可以作为一种方法来估算低剂量受照者的辐射剂量,但是需要更多的资料来完善。     

桑牛强生胶囊对4.0 Gy照射小鼠免疫功能的影响

目的 观察桑牛强生胶囊对60Coγ射线4.0 Gy照射小鼠免疫功能的影响.方法 小鼠离体抗体形成细胞(溶血分光光度法)和脾淋巴增殖细胞转化功能检测4.0 Gy照射小鼠和细胞免疫功能.结果 桑牛强生胶囊1.6、0.4g/kg剂量组可明显提高4.0 Gy照射小鼠血清抗体水平(P<0.01、P<0.05),桑牛强生胶囊1.6、0.4 g/kg剂量组刺激指数均明显高于模型对照组(P<0.01或P<0.05),提高对60Co γ射线所致免疫低下小鼠淋巴细胞产生抗体及促进细胞免疫功能,可不同程度的恢复受照射小鼠的细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能.2个剂量治疗组与模型对照组比较差异有显著性(分别为P<0.05,P<0.01).结论 桑牛强生胶囊可以明显提高对60Co γ射线所致免疫低下小鼠淋巴细胞产生抗体及促进细胞免疫的功能.     

电离辐射与T细胞突变频率的剂量效应关系曲线的建立与验证

目的 建立T细胞受体基因突变频率(T cell receptor mutation frequency,TCR MF)与电离辐射剂量效应关系曲线.方法 招募8名健康成年人,4男4女.采集其外周血,分离淋巴细胞,分装到12孔培养板中,不同剂量(0.00～8.00 Gy)照射后,用植物血凝素蛋白(PHA-P)刺激,加人重组白介素-2(IL-2)培育7d,以流式细胞仪测量TCR MF,拟合剂量-效应曲线.另招募16例不同类型、照射方式及照射剂量的癌症放疗患者,采集外周血,用同样方法分离培养淋巴细胞,测量TCR MF,用拟合的剂量-效应曲线估算肿瘤放疗患者全身等效剂量.采集外周血,观察淋巴细胞染色体双着丝粒和着丝粒环畸变情况,估算受照剂量.结果 TCR MF与电离辐射在0.00～8.00 Gy剂量范围内剂量效应关系良好;大剂量组(2.00 ～8.00 Gy)、小剂量组(0.00～1.00 Gy)及0.00～8.00 Gy剂量组拟合曲线均符合二次多项式模式,拟合方程分别为TCR MF=- 32.8579+ 20.5436D+0.6341D2、TCR MF=1.796+0.017D+ 5.155D2和TCR MF=-0.6229+6.305D+0.6919D2,D为辐射剂量(Gy).用实验建立的曲线估算肿瘤放疗患者的全身受照剂量,与用染色体双着丝粒和着丝粒环畸变率估算的剂量平均相对标准偏差为16.8％.结论 应用TCR基因突变分析技术拟合出的辐射剂量效应曲线,可应用于电离辐射事故受照者近期受照剂量的估算.     

大豆异黄酮和玉米赤霉烯酮对卵巢癌细胞株PEO4增殖的影响

目的 通过观察大豆异黄酮(genistein,GS)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对卵巢癌细胞(PEO4)增殖的影响探讨其雌激素效应。方法 雌激素受体阳性卵巢癌细胞株PEO4在达克尔培养基(DMEM,含小牛血清10％)中采用开放式单层贴壁培养,于加受试物5d前将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后改在无酚红高糖DMEM(含活性碳-葡聚糖苷处理过的胎牛血清5％)中培养,实验设溶剂对照、雌激素对照、抗雌激素对照和2种受试物各4个剂量组,采用噻唑蓝法、^3H—TdR掺人法及流式细胞术对PEO4细胞的增殖情况进行分析。结果 与溶剂对照组相比较,96μmol/L对PEO4处理24h,可明显抑制PEO4细胞增殖和细胞DNA合成,并将细胞周期阻滞在G2／M;随着培养时间延长至48h,32μmol/L GS也能明显抑制PEO4细胞增殖,在浓度低于8μmol/L时,GS有促进细胞增殖的趋势。ZEA对PEO4增殖的影响与雌二醇类似,96nmol/L ZEA对细胞处理24h可明显促进PEO4细胞增殖和细胞DNA合成,并将细胞周期由G0／Gl向S期推进,提高细胞分裂增殖指数。结论 ZEA具有较强的雌激素效应,在较低的浓度条件下(8nmol/L,92h)即可促进雌激素受体阳性细胞PEO4的增殖作用;GS对PEO4细胞的影响作用比较复杂,较低浓度的GS(＜10nmol／L)促进细胞的增殖作用,而在高浓度的处理条件下则抑制细胞的增殖作用。这些资料提示高剂量的GS有抗卵巢癌的作用,而ZEA具有雌激素样效应。     

不同剂量γ射线照射人肝细胞株对BMPR2基因表达的影响研究

目的 探讨人肝细胞株受不同剂量照射及照后不同时间点对骨形态蛋白受体2(BMPR2)的影响,试图为肝细胞的早期损伤提供依据。方法 利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对人肝细胞株受0.1、0.2、0.5、1、2、4 Gy不同剂量⁶⁰Co γ射线照射及照后6、12、24 h点对BMPR2的表达情况进行研究。结果 照后不同剂量点和不同时间点BMPR2基因和β-actin内参基因的溶解曲线均为单峰,说明均为特异性的扩增产物;照后6 h点BMPR2基因不同剂量的相对定量比值均小于1,说明均为下调表达;照后12 h点BMPR2基因不同剂量的相对定量比值均大于1,说明均为上调表达;照后24 h点BMPR2基因除个别剂量点表现为下调表达趋势(0.2 Gy和2.0 Gy点),其余剂量点均表现为上调表达趋势。结论 BMPR2受不同剂量照射未表现出剂量效应关系,但随着照后时间不同,其表达趋势差异明显。