整合连接激酶在血管内皮生长因子诱导视网膜新生血管形成的信号传导通路中的作用

目的 观察整合连接激酶（ILK）在血管内皮生长因子（VEGF）诱导的视网膜新生血管形成过程中的作用。方法 在体外培养的视网膜脉络膜血管内皮细胞（RF/6A细胞系）中，用LY294002抑制ILK活性或siRNA转染敲减ILK表达后，检测ILK对VEGF诱导的细胞黏附、增生、迁移及内皮细胞管状结构形成的作用；并在动物模型水平观察LY294002抑制ILK活性后对视网膜新生血管形成的影响。结果 正常对照组、VEGF处理组、LY294002抑制组、siRNA转染组细胞黏附实验结果分别为（0.0726±0.01961）、（0.1137±0.02631）、（0.0837±0.01503）、（0.0853±0.02454），VEGF处理组与正常对照组比较，差异有统计学意义（t =4.211，P<0.01）；LY294002抑制组以及siRNA转染组与VEGF处理组相比，差异有统计学意义(t =3.074 和2.91，P<0.01）。正常对照组、VEGF处理组、LY294002抑制组细胞增生实验结果分别为（0.4162±0.1392）、（0.6412±0.2420）、（0.4476±0.1834），VEGF处理组较正常对照组比较，差异有统计学意义（t=2.608，P<0.05）；LY294002抑制组与VEGF处理组相比，差异也有统计学意义（t=2.244，P<0.05）。正常对照组、VEGF处理组、LY294002抑制组细胞迁移实验结果分别为（83.66±30.283）、（248±74.748）、（138.5±38.167），VEGF处理组与正常对照组比较，差异有统计学意义（t=5.436，P<0.01）；LY294002抑制组与VEGF处理组相比，差异也具有统计学意义（t=3.682，P<0.01）。血管内皮细胞管状结构形成实验显示，ILK活性或表达受到抑制后无明显管状结构形成。动物实验显示腹膜下注射LY294002使视网膜后极部无灌注区面积从（62798±16995.62）μm2增加至（84722.65±10435.01） μm2，二者比较，差异有统计学意义（t=3.476，P<0.01）。 结论 应用LY294002抑制ILK活性或siRNA转染敲减ILK表达使细胞黏附率、细胞增生率及细胞迁移率均显著下降。ILK通过参与调控VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞黏附、增生、迁移及内皮细胞管状结构形成过程而对VEGF诱导的视网膜新生血管形成过程发挥着重要作用。     

重组人血管抑制因子Vasostatin对视网膜血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨重组人血管抑制因子Vasostatin对体外培养的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF／6A)增殖的影响。方法 以bFGF刺激增殖，体外培养恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF／6A)至4代，分别加入不同质量浓度的重组人Vasostatin蛋白，并采用MTT法、^3H-TdR法检测2、4、6d时其对血管内皮细胞增殖抑制的作用，同时利用流式细胞仪对重组人Vasostatin蛋白是否诱导细胞凋亡进行了探讨。结果 MTT法、^3H-TdR两种方法均显示重组人Vasostatin蛋白以质量浓度依赖的方式抑制bFGF刺激的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF／6A)的增殖。流式细胞仪检测显示加入重组人Vasostatin蛋白后，G0／G1期无明显的亚二倍体核形峰出现，其不是通过诱导细胞凋亡的方式来抑制细胞增殖的。结论 重组人Vasostatin蛋白在体外具有抑制bFGF诱导的血管内皮细胞增殖的作用，其有可能成为一种有效的血管新生抑制剂。     

LY294002对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增生的影响

目的探讨LY294002对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的兔晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法兔眼LECs经培养后,将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002分别加入LECs培养基中培养48h为LY294002组。另将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002＋bFGF（10mg／L）加入培养基中培养LECs48h。bFGF（10mg／L）诱导LECs增生48h为阳性对照组,空白对照组仅用无血清DMEM。MTT比色法测定吸光度（A）值,分析各组药物对LECs增生的抑制率,流式细胞仪检测各细胞周期的LECs百分率。结果bFGF组与空白对照组相比A值升高,LY294002组随着药物浓度的增加,4值明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。bFGF＋LY294002组与LY294002组相比,A值下降更明显,差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪分析LY294002对LECs的抑制作用与MTT呈现相同趋势,随着LY294002浓度的增加,处于G0／G1期的LECs逐渐增加（P〈0．01）,而S期和G2／M期逐渐减少。结论LY294002可明显抑制体外培养的bFGF诱导的兔LECs的增生,并呈剂量依赖关系,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1抑制视网膜血管新生的实验研究

背景寻求有效的血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂是治疗和预防新生血管性眼病的关键。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1（IGFBP—rP1）是一种新发现的抑血管新生因子,推测其在眼内有抑制VEGF的作用。目的探讨IGFBP—rP1对VEGF体外诱导视网膜新生血管形成的抑制作用及其机制。方法使用含质量分数10％FBS的DMEM对猕猴视网膜／脉络膜血管内皮细胞株（RF／6A）进行扩增培养,利用免疫荧光细胞化学染色法观察RF／6A细胞表达IGFBP—rP1的情况。RF／6A细胞血清饥饿法培养24h后分为对照组、10mg／LVEGF组,50、100、200mg／LIGFBP—rP1＋10mg/L VEGF组进行干预,分别利用MTS比色法、Transwell实验和流式细胞术比较IGFBP—rP1（0、50、100、200mg／L）联合VEGF（10mg／L）作用后,RF／6A细胞在增生、移行和凋亡等生物学行为方面的变化。结果RF／6A细胞用不同质量浓度的IGFBP—rP1培养后细胞质呈FITC激发后的绿色荧光,细胞核呈PI激发后的红色荧光,而对照组细胞仅见细胞核的红色荧光。10mg／LVEGF组RF／6A细胞的A490值、移行细胞数与对照组相比明显增加,差异均有统计学意义（t=-15．191,P=0．000;t=-21．274,P=0．000）,细胞凋亡率明显下降,差异有统计学意义（t=10．228,P=0．000）。与10mg／LVEGF组相比,IGFBP—rP1（50、100、200mg／L）＋10mg／LVEGF组RF／6A细胞的A490值、移行细胞数明显下降（均P〈0．05）。50、100、200113geLIGFBP—rPl＋10mg／LVEGF组RF／6A细胞的细胞凋亡率分别提高了（1．26±0．04）％、（1．50±0．07）％和（1．93±0．27）％,各组的总体差异有统计学意义（F=274．273,P=0．000）。结论IGFBP—rP1作为一种内源性因子,通过促细胞凋亡机制抑制VEGF诱导的视网膜血管的生成。     

金雀异黄素衍生物对糖基化终产物损伤猴视网膜血管内皮细胞的保护作用

目的研究7-二氟亚甲基-5,4’-二甲烷氧基异黄酮（dFMGEN）对糖基化终产物损伤的猴视网膜血管内皮细胞的影响。方法制备RF／6A细胞糖基化终产物损伤模型,用不同浓度的dFMGEN（1、3、10、30、100μmol／L）进行干预,MTT法观察dFMGEN对细胞生长增生的影响,流式细胞术检测dFMGEN对细胞凋亡的影响。结果糖基化终产物孵育RF／6A细胞48h,可明显抑制细胞生长、促进凋亡;dFMGEN与糖基化终产物共同孵育RF／6A细胞48h,能有效降低增生抑制率,减少凋亡,并呈浓度依赖性。100μmol／L dFMGEN比相同浓度的先导化合物金雀异黄素（GEN）和阳性药物Vit B1作用更强。结论dFMGEN对糖基化终产物引起的视网膜血管内皮细胞的损伤具有保护作用。     

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响

目的:观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响,初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法:采用细胞划痕实验测定tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下RF/6A细胞(恒河猴视网膜微血管内皮细胞)迁移的影响;Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化。结果:Tumstatin肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用,呈剂量依赖性。正常情况下,RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达,但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白,而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达(加入20mg/LT8肽30,45,60min时蛋白表达受到显著抑制,差异有显著性意义,P<0.01)。结论:Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与P38MAPK通路有关。     

PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞中S期激酶相关蛋白2表达的影响

目的探讨PI3K抑制剂LY294002对体外培养的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和细胞周期S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达的影响。方法 MTT比色法检测25μmol/L的LY294002处理人LECs细胞株SRA01/04后12h和24h细胞的增生情况;流式细胞仪检测LY294002作用24h后细胞周期的分布情况;Westernblot和real-timePCR法分别测定LY294002处理24h后细胞中Skp2及其mRNA的表达情况。结果 25μmol/L的LY294002作用于SRA01/04细胞0～24h,SRA01/04细胞的增生受抑制,且作用24h时对SRA01/04细胞的抑制作用最明显。LY294002组中处于G1期和S期的细胞占总细胞数的百分率分别为（66.15±2.63）%和（27.34±6.58）%,对照组为（56.73±1.35）%和（37.32±5.54）%,LY294002组细胞Skp2及其mRNA的表达量明显减少。结论 PI3K抑制剂LY294002可抑制人LECs的增生,使部分细胞停滞于细胞周期的G1期,LY294002抑制人LECs的增生可能与Skp2的表达下调有关。     

三氧化二砷对体外培养的人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究

目的 观察三氧化二砷（As2O3）对体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生抑制及凋亡诱导作用。方法 不同浓度的As2O3理细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，四唑盐（MTT）比色法检测人RPE细胞对As2O3的药物敏感性，流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡率。结果 药物处理后细胞出现凋亡形态改变。MTT比色法结果显示，As2O3作用血清组人RPE细胞后各实验组与对照组之间吸光度比较有统计学意义，药物剂量分别为：作用24h为6．25μmol／L（P=0．018）、48h为6．25μmol／L（P〈0．01）、72h为1．56μmol／L（P〈0．01）；作用无血清组细胞48h后为12．5μmol／L（P〈0．01）。流式细胞仪分析结果显示As2O3作用人RPE细胞周期改变表现为S期阻滞及G2／M期延长。As2O3处理人RPE细胞后出现凋亡峰。结论 As2O3可抑制体外培养的人RPE细胞的生长并诱导其凋亡，有望为临床防治增生性玻璃体视网膜病变（PVR）提供新的药物干预。     

LY294002对人晶状体上皮细胞蛋白激酶B活化的影响

背景蛋白激酶B（Akt）与许多细胞信号转导通路密切相关,从而参与多种细胞功能活动的调控,包括细胞的增生、迁移和代谢等,其中磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）可催化Akt活性并启动各种相关的细胞信号通路。P13K抑制剂能够抑制Akt活性,但是否影响后发性白内障发生过程中残留的晶状体上皮细胞（LECs）的生物学行为尚不清楚。目的观察P13K抑制剂LY294002对人LECs中Akt活化的影响。方法对人LECs系HLEC-B3细胞进行常规培养和传代,然后接种于96孔板中,培养24h后在培养板中加入LY294002,终浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80μmol／L,继续培养24h后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞的增生抑制率。在同一批接种于6孔板内无菌盖玻片上的传代细胞中加入10μg／L转化生长因子-β2（TGF—β2）为诱导组,用20μmol／LLY294002预培养1h后再加入10Ixg／LTGF—β2进行共培养为TGF—B,与LY294005共培养组,以未加入TGF,p：和LY294002的细胞作为对照组,应用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞中磷酸化Akt（p-Akt）的荧光表达情况,并用Westernblot法检测各组细胞中p-Akt表达量的差异。结果CCK-8法检测结果显示,随着LY294002浓度的增加,HLEC—B3的吸光度（A）值逐渐减小,即LY294002对HLEC—B3细胞增生的抑制作用随浓度的增加而逐渐增强,不同浓度LY294002组间HLEC—B3的A值比较差异有统计学意义（F分组=9．72,P=0．00）;随着检测时间点的延长,HLEC—B3的4值逐渐增大,不同检测时间点A值比较差异有统计学意义（F时间=1737．54,P=0．00）。激光扫描共焦显微镜观察显示,对照组细胞仅有微量的p-Akt红色荧光,诱导组p-Akt表达明显增多,并向细胞膜聚集,细胞轮廓清晰,而TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt表达的红色荧光明显减弱,细胞形态不清。Westernblot法检测结果显示,对照组、诱导组和TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt的表达量分别为0．91±0．08、1．48±0．13和0．95±0．19,3个组间差异有统计学意义（F=15．04,P=0．00）。结论LY294002能够拈抗TGF—β2诱导的Akt磷酸化激活过程,有望成为新的有效防治后发性白内障的药物。     

黄芩素对人眼球筋膜囊成纤维细胞增生的影响

目的探讨黄芩素对人眼球筋膜囊成纤维细胞（human Tenon’s capsule fibroblasts，HTCFs）增生的抑制作用。方法采用MTT法检测黄芩素对体外培养的HTCFs增生的影响，并计算细胞生长抑制率为50％时黄苓素的药物浓度，用免疫组织化学法分析观察黄芩素对HTCFs增殖细胞核抗原表达的影响，流式细胞仪检测黄芩素对HTCFs细胞周期的影响。结果黄芩素可以抑制体外培养的HTCFs增生，且抑制能力与药物剂量成正比。50％细胞生长抑制率时的药物浓度为23．70μmol · L^-1。当黄芩素浓度≥30μmol · L^-1时能剂量依赖性地抑制细胞对增殖细胞核抗原的表达（P〈0．01）。流式细胞仪检测黄芩素可以将HTCFs的细胞周期阻滞在G0／G1期，以作用后48h最为显著。黄芩素还可以诱导HTCFs凋亡，以作用后12h的凋亡峰值最高（10．6％），且坏死细胞碎片较对照组显著增多。结论黄芩素既可以抑制HTCFs的增生，又可以诱导它的凋亡。黄芩素有望成为翼状胬肉和青光眼术后抗增生药物。