实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的应用评价

目的探讨实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA浓度的检测范围和检测健康人全血中核酸DNA的Ct本底值。方法采用试剂盒提取纯菌、健康人和临床患者血液中的核酸DNA,应用实时荧光定量PCR进行检测。结果经检测,40份健康人群血液标本Ct值平均值为37.0,标准差为1.9,Ct值95%置信区间为33.0 ~ 38.8。 将布鲁氏菌核酸DNA标准品倍比稀释（56.2 ng ~ 0.026 5 fg）,实时荧光定量PCR检测灵敏度为6.7 fg。结论实时荧光定量PCR检测纯菌核酸DNA的灵敏度相当于2个基因组DNA拷贝数,但用于检测血液标本尚待进一步研究。     

两种扩增仪对联合毛细管电泳技术的聚合酶链式反应的影响

目的使用两种扩增仪进行常规扩增和毛细管电泳,观察两种扩增仪对结果的影响以及有何不同。 方法运用 PowerPlex 试剂盒对 DNA 在 Applied Biosystems 9700 和 Hema 9700 两种扩增仪上进行扩增,扩增包括对血卡进行直接扩增和对提取后的 DNA 进行扩增,然后在 Applied Biosystems 3130XL 上进行毛细管电泳检测;使用同一 DNA 进行 5 次重复试验进行扩增仪的稳定性检测;使用 7 种非人样本 DNA 进行种属特异性检测;运用不同稀释度的 2800 阳性标准品进行灵敏度检测;对使用两种扩增仪扩增检测后的所有结果进行分析、讨论和评价。 结果使用两种扩增仪进行扩增检测后,其分型结果在两种扩增仪之间没有明显差别,其分型结果均稳定准确且在两种扩增仪上呈现一致性,种属特异性检测结果一致,灵敏度检测结果一致。 结论两种扩增仪在进行常规扩增检测时,其结果在两种扩增仪之间没有明显差别,其结果呈现出一致性,两种扩增仪均可应用于常规扩增。      

2017年云南省剑川县鼠形动物中巴尔通体感染状况调查

目的调查2017年云南省剑川县鼠形动物中巴尔通体的自然感染情况。方法2017年3—7月在剑川县用笼捕法捕获鼠形动物，无菌采集其股动脉血并提取DNA，应用荧光定量PCR技术进行巴尔通体检测，对检测阳性的血液样本进行巴尔通体分离培养。结果从剑川县沙溪镇石龙村及金华镇西门社区共捕获鼠形动物372只；经荧光定量PCR检测，阳性208份，阳性率为55.91%；11种鼠形动物中有10种检出阳性，其中大绒鼠的阳性率为38.73%，齐氏姬鼠为72.49%，贝氏树鼩为7.14%，中华姬鼠为77.78%，赤腹松鼠、社鼠、褐家鼠为50.00%，大足鼠、巢鼠为100.00%；阳性样本经分离培养后获得19株巴尔通体。结论TaqMan探针荧光PCR技术是巴尔通体感染的快速诊断方法。 剑川县鼠形动物中感染较高的为巴尔通体，受感染的鼠种较多，其中以齐氏姬鼠与大绒鼠较高，人群与外环境的鼠类接触存在感染发病的风险。     

基于M1磁珠富集血液中念珠菌快速检测方法的建立

  目的  建立3种基于重组人甘露聚糖结合凝集素（MBL）蛋白（M1蛋白）磁珠富集技术的血液微量念珠菌快速检测方法（荧光定量PCR法、微培养法、铺板培养法）。  方法  根据荧光定量PCR方法的扩增效果,比较3种裂解液（酵母裂解液、LSTE和TXTE）提取微量念珠菌DNA的效果;通过检测液体培养后的菌量,比较5种微培养液（PBS、SA、YPD、LB和BHI）的增菌效果;使用人血浆模拟样本评价建立的3种方法和标准血培养法对血液中微量念珠菌的检测效果。  结果  与TXTE和LSTE相比,酵母裂解液提取微量念珠菌DNA的效果最佳。 SA、YPD、LB和BHI 4种微培养液中的菌量随时间延长均有上升趋势,特别是BHI增菌效果最佳。 人血浆模拟样本中,荧光定量PCR法虽然能够在最短时间内（3.75 h）检测到病原菌,但不能检出全部阳性样本。 与传统血培养法相比,微培养法和铺板培养法可分别提前至少39 h和22 h获得检测结果,灵敏度为10菌落形成单位/mL（CFU/mL）。  结论  与传统血培养法相比,荧光定量PCR法、微培养法和铺板培养法均能有效缩短检测时间,并且有较高的特异性和灵敏度。     

影像学联合三种分子诊断技术诊断结核病的价值

目的评估GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探针荧光定量PCR、RNA恒温扩增法3种不同原理的分子生物学检验方法联合影像学表现对结核病诊断的价值。方法收集胸部X线检查表现怀疑结核分枝杆菌感染的患者标本38例,以临床诊断结核病为金标准,比较GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探针荧光定量PCR法、RNA恒温扩增法3种分子生物学检验方法的敏感度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果胸部X线检查怀疑结核分枝杆菌感染的患者中,23名临床诊断为结核病,15名临床排除结核病。GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探针荧光定量PCR、RNA恒温扩增法检测的敏感度分别为87.0%、52.2%和13.0%,阴性预测值分别为83.3%、57.7%和43.2%,差异具有统计学意义（P < 0.05）。3种方法的阳性预测值均为100%。GeneXpert MTB/RIF方法的敏感度和阴性预测值最高,其次为TaqMan探针荧光定量PCR法,RNA恒温扩增法敏感度和阴性预测值最低。结论对于胸部X线检查怀疑结核分枝杆菌感染的患者,GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌具有更高的敏感度,在结核病诊断中具有较好的辅助诊断价值,应推荐成为结核分枝杆菌感染检测的首选分子生物学方法。      

侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌

目的利用侧流层析–重组酶聚合酶扩增（LF-RPA）技术建立快速、敏感、特异的土拉弗朗西斯菌（土拉菌）检测方法。方法基于土拉菌特异性基因（tul4）设计重组聚合酶恒温扩增方法的引物及探针,优化反应时间和温度,同时评价该方法的灵敏度及特异性,并通过模拟血液样品评估此方法的实用性。结果该方法最佳反应条件是40 ℃,20 min,可检测核酸浓度最低为20 fg/μl,与实时荧光定量PCR（qPCR）方法相近,且不与7种非土拉菌发生交叉反应。 土拉菌模拟样本最低检测浓度为460 CFU/ml。结论该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,在临床及现场检测土拉菌中具有应用前景。     

外周血淋巴细胞布鲁氏菌核酸DNA检测的实验研究

目的基于目前布鲁氏菌病诊断现状,针对试管凝集滴度小于1∶100且布鲁氏菌病相应症状未持续1年患者,探讨其外周血淋巴细胞中布鲁氏菌DNA用于临床诊断的可能性。方法收集患者的血液,分离其外周血淋巴细胞和血清,分别提取其核酸,利用布鲁氏菌鉴定引物B4/B5进行普通PCR扩增,检测患者体内是否存在布鲁氏菌DNA。结果2017年1月1日至2018年2月28日期间共收集布鲁氏菌病患者血液样本278份,其中82份样品试管凝集检测滴度为小于1∶100,且患者病程未持续1年。 82份样品中分离自患者外周血淋巴细胞核酸中检测到布鲁氏菌核酸阳性样品为50份,而对应血清布鲁氏菌核酸阳性样品为15份,两者差异有统计学意义（P＜0.05）。 在血清抗体5个滴度段中SAT阴性、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200,SAT阴性组患者全血淋巴细胞中布鲁氏菌核酸DNA检测率最高,1∶200组患者血清布鲁氏菌核酸DNA检出率最低。结论全血外周血淋巴细胞核酸布鲁氏菌DNA检测可用于血清抗体检测阴性患者的初步诊断,为布鲁氏菌病的诊断提供新的补充方法。     

STR峰高与峰下面积在干细胞移植后状态判断的应用探讨

目的 探讨短串联重复序列（STR）信息位点的峰高与峰下面积在异基因造血干细胞移植后嵌合状态判断中的作用,寻找适合于异基因造血干细胞移植状态判断的指标.方法 分别采集两名无关供者及M2患者及其HLA全相合供者两组血标本,以白细胞含量为依据制备不同比例混合血样,提取DNA,使用STR试剂盒,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测扩增片段,筛选得到理想的信息位点,获取其峰高及峰面积进行移植嵌合率的计算.结果 各筛选位点以峰高或面积得出的模拟嵌合率间差异均无统计学意义,且各位点模拟嵌合率与制备的浓度梯度之间的相关系数均在0.9965以上.结论 峰高或峰下面积均可作为嵌合状态的定量监控指标.     

母体血循环中胎儿游离DNA的检测

目的寻找一种无创性产前基因检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的新方法。方法提取32名健康孕妇血浆标本中胎儿游离DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增其性别决定基因（sex-determiningregion Y，SRY），并引入内参照基因序列ArrLl；并采用16个短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR）多态性位点的多重荧光PCR方法对血浆标本中DNA进行STR等位基因扩增。同时，检测孕妇及其丈夫的外周血白细胞DNA，进行基因扫描及对照分析。结果经SRY-PCR检测发现，17名妊娠男胎孕妇血浆中均出现基因扩增带，其余15名妊娠女胎孕妇中有2名出现假阳性，性别总符合率为94％（30／32）。经STR-PCR检测发现，均从孕妇血浆中检测出父源性胎儿DNA的存在。结论应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断准确性较高，是一种无创性产前基因诊断方法，具有广泛的临床应用前景。     

检测STR多态位点作为非性别依赖胎儿标记的探讨

本研究探讨检测孕妇血浆中游离胎儿DNA短串联重复序列（short tandem repeat,STR）多态位点作为内对照进行遗传病产前基因诊断的可行性。用QIAamp DNA Kit抽提孕妇血浆DNA,应用AmpFlSTR profiler试剂盒扩增9个（D3S1358,VWA,FGA,D5S818,D13S317,D7S820,D8S1179,D21S11,D18S51）具有高度多态性的STR位点,以多重荧光PCR方法对不同孕期的36份孕妇血浆标本中胎儿DNA进行STR等位基因扩增,同时扩增孕妇及丈夫外周血来源DNA的STR位点。PCR产物经ABI Prism 377序列分析仪电泳后,用基因扫描软件进行分析,以在孕妇血浆中胎儿DNA检出父源性STR等位基因来确认胎儿DNA存在。结果表明：其中孕早期4份（4/6）、孕中期19份（19/20）、孕晚期9份（9/10）样本中检出胎儿父源性等位基因,即胎儿DNA。4份样本未检到胎儿DNA。结论：应用多重荧光PCR方法对孕妇血浆中胎儿DNA进行STR多态位点的复合扩增,可获得男性及女性胎儿性别DNA信息,作为非性别依赖胎儿标记,从而用于无创伤性产前诊断。     

The clinical significance of Ig heavy chain and TCRgamma gene rearrangement detected in free DNA in plasma in patients with non-Hodgkin lymphoma

OBJECTIVE: To evaluate the clinical significance of IgH and TCRgamma gene rearrangement in plasma free DNA in patients with non-Hodgkin Lymphoma (NHL). METHODS: Plasma free DNA in 74 patients with NHL were extracted and identified by Globin gene. IgH (FR3A/VLJH), TCRgamma (TVG/TJX) clonal rearrangements were amplified by PCR and compared with results of mononuclear cell DNA and pathological biopsy sample DNA. RESULTS: Plasma free DNAs were successfully obtained from 58 cases (35 B-NHL and 23 T-NHL) of newly diagnostic, refractory and relapsed NHL out of total 74 patients (78.4%), but not found in the rest 16 patients in remission. Of 35 B-NHL cases, 31 showed IgH rearrangement (88.6%), and none with TCRgamma rearrangement; of 23 T-NHL cases, 8 showed TCRgamma rearrangement (34.8%), and 2 with IgH gene rearrangement synchronously. In comparation with the results of IgH and TCRgamma gene rearrangement in biopsy samples in 30 B-NHL cases, 26 cases in plasma free DNA (86.7%) and 24 in biopsy samples (80%) were positive (P > 0.05). In 20 T-NHL patients, 7 cases in plasma cell-free DNA (35%) and 6 cases in biopsy samples (30%) were positive (P >0.05). CONCLUSIONS: Tumor-derived DNA could be detected in plasma from underlying cancer patients. For NHL patients, detecting IgH and TCRgamma gene rearrangement in plasma free DNA has the same clinical significance as in biopsy samples.     

2015-2019年上海市急性呼吸道感染病例人冠状病毒感染情况分析

  目的   了解上海市急性呼吸道感染病例中人冠状病毒（HCoV）的分布特征,深入了解HCoV的流行规律,为其防控提供科学依据。   方法   收集2015 — 2019年上海市急性呼吸道感染监测标本3 531份,利用多重PCR技术进行常见呼吸道病原体的检测。   结果   在3 531份标本中,病毒总检出率为39.73%（1 403/3 531）。 其中,HCoV检出率为3.14%（111/3 531）。 HCoV在急性呼吸道感染病例中的总检出率仅次于流感病毒和人鼻病毒/肠道病毒,流行亚型以HCoV-OC43、HCoV-NL63为主,不同HCoV亚型在人群中呈隔年交替流行的趋势。 混合感染发生率高达36.93%（41/111）,混合感染病例中的重症比例较高。   结论   HCoV是上海市急性呼吸道感染的重要病原,应加强急性呼吸道感染病例病原学监测,重点关注HCoV与其他病原的混合感染。     

非霍奇金淋巴瘤患者血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排的检测及临床意义

目的 检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者外周血血浆游离DNA免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体γ(TCRγ)基因克隆性重排并探讨其临床意义.方法 提取74例NHL患者血浆游离DNA并以Globin基因确定其存在,通过PCR方法 检测IgH(FR3A/VLJH)和TCRγ(TVG/TJX)克隆性基因重排,并分别与外周血单个核细胞DNA、病理组织学检查进行比较.结果 74例患者中有58例(35例B-NHL和23例T-NHL)初诊、难治或复发的患者血浆游离DNA提取成功,另16例临床缓解患者未提取出血浆游离DNA.35例确诊的B-NHL患者中IgH基因单克隆重排阳性31例(88.6%),无一例出现TCRγ基因单克隆重排,23例确诊的T-NHL患者中TCRγ基因单克隆重排阳性8例(34.8%),其中2例同时出现IgH基因单克隆重排.在50例同时获得病理活检标本基因重排结果 的病例中,30例B-NHL患者血浆DNA IgH基因重排阳性26例(86.7%),病理活检标本阳性24例(80.0%)(P＞0.05);20例T-NHL患者血浆DNA TCRγ基因重排阳性7例(35%),病理活检标本阳性6例(30%)(P＞0.05).结论 NHL患者血浆中可以检测出肿瘤源性的血浆游离DNA;NHL患者血浆游离DNA IgH、TCRγ基因重排的检测简单、方便、相对无创,与病理活检标本的检测具有相同的临床意义.     

声脉冲辐射力弹性成像在颈部淋巴结良恶性诊断中的价值

目的探讨声脉冲辐射力成像（ARFI）中声触诊组织成像（VTI）与声触诊组织定量（VTQ）技术在颈部淋巴结良恶性鉴别诊断中的应用价值。 方法分析65例100个颈部淋巴结疾病患者的常规超声及ARFI成像特征,测量淋巴结VTI图像与二维图像面积比及其SWV值,以病理学结果作为金标准,绘制ROC曲线,获得区分颈部淋巴结良恶性VTI面积比值及SWV的临界值。 结果5个常规超声评价指标中P < 0.01的有短径/长泾、淋巴门及微钙化,它们在常规超声鉴别颈部淋巴结良恶性的敏感度、特异度及准确度分别为84.81%,90.47%,86%;86.07%,95.23%,88%;0,52.38%,11%。非特异性反应性淋巴结组VTI面积比为1.07±0.26,恶性淋巴结组的VTI面积比为1.68±0.31,两者相比差异具有统计学意义（T=8.9356,P < 0.001）。非特异性反应性淋巴结组的SWV值为1.72±0.89 m/s,恶性淋巴结组的SWV值为2.68±0.48 m/s,二者比较差异具有统计学意义（T=4.7141,P < 0.001）。构建VTI及SWV的ROC曲线后,其AUC分别为0.799和0.862,根据ROC曲线选取鉴别良恶性淋巴结的VTI面积比及SWV值的临界值分别为1.2、1.9,其对应的敏感度、特异度、准确度分别为96.20%,95.23%,96%;89.87%,90.47%,90%。 结论ARFI弹性成像有助于鉴别颈部淋巴结的良恶性。       

Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma

BACKGROUND: Plasma and serum samples have been used to detect cell-free genomic DNA in serum or plasma in certain pathologic conditions such as systemic lupus erythematosus, pulmonary embolism, and malignancies, as well as in fetal cell chimerisms in maternal serum and/or plasma. In this study, baseline concentrations of cell-free DNA in serum and plasma samples were evaluated for the study of posttransfusion chimerism. STUDY DESIGN AND METHODS: DNA was extracted from fresh or stored (4 degrees C for 1-6 days) normal donor serum or plasma samples (ACD; EDTA) by using reagents from an HIV assay kit. After incubation and washing of samples, purified DNA was amplified with HLA DQ-alpha primers (GH26 and 27) or human Y-chromosome primers (SA and SD) to quantitate the concentration of genomic DNA. RESULTS: Fresh serum samples had concentrations of cell-free DNA that were about 20-fold higher than the concentrations in fresh plasma samples. The concentration of cell-free genomic DNA in serum samples increased daily, to a level more than 100 times baseline after clotted blood tubes were stored at 4 degrees C for 4 to 5 days. There was a small increase in cell-free plasma DNA in stored ACD whole blood samples. Male WBCs, spiked into fresh nonanticoagulated female blood, were lysed during the process of clotting, with male DNA liberated into the serum samples. CONCLUSION: Most cell-free DNA in serum samples is generated during the process of clotting in the original collection tube. The concentration of cell-free genomic DNA in fresh plasma is probably the same as that in circulation. Consequently, while serum samples should not be used to monitor the concentration of cell-free DNA in a patient's circulation, serum collected from sample tubes containing clots (i.e., without anticoagulant), 3 to 5 days after the date of phlebotomy, could be useful as a source of DNA with which to screen for posttransfusion microchimerism.     

A 族链球菌胶体金免疫层析试纸条的制备及应用

目的建立一种以胶体金为基础的A族链球菌（Strep-A）免疫层析快速检测方法 方法以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析试纸条,并对其特异性、灵敏度以及临床应用进行评价。 结果最低检出浓度为105 CFU/mL;10 min内即可观察结果;与B族链球菌、D族链球菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;检测229例临床样本,以传统的细菌培养鉴定结果为对照,敏感度为97.30%,特异度为98.06%,kappa值为0.950,一致性检测表明两者无显著性差异。 结论该方法方便、快捷,能有效的辅助诊断A族链球菌感染,胶体金免疫层析试纸的研制为Strep-A进行现场快速诊断与筛查奠定了基础。      

Relative quantitation of cell-free fetal DNA in maternal plasma using autosomal DNA markers

BackgroundCell-free fetal DNA in maternal plasma presents interest as it can possibly serve as a pregnancy associated biomarker. For its quantitation, we investigate the use of fluorescent polymerase chain reaction (PCR) amplification of short tandem repeats (STRs) in pregnancies irrespective of sex.MethodsArtificially chimeric DNA samples were prepared so as to simulate cell-free fetal DNA in maternal plasma at different proportions. The samples were tested with fluorescent PCR amplification of informative STRs and the percentage of the population simulating fetal DNA was plotted against a relative ratio of the alleles detected in each sample. The graphs were used for the quantitation of cell-free fetal DNA in 50 maternal plasma samples.ResultsDetection of at least one paternally inherited fetal STR was possible in 46/50 pregnancies leading to the estimation of the relative percentage of cell-free fetal DNA. Four pregnancies failed to reveal any fetal allele which may reflect undetectable levels (< 1%) of fetal DNA. Among pregnancies fetal DNA ranged from 0 to 20% (mean value of 7%).ConclusionOur system can readily estimate the relative levels of cell-free fetal DNA in maternal circulation, normal gestations of either sex and can be exploited for estimating possible variations of this analyte between normal and pathological pregnancies.     

Presence of cell-free fetal DNA in plasma of women with ectopic pregnancies

BACKGROUND: The quantity of cell-free fetal DNA in the plasma of pregnant women changes during pregnancy and seems to be different in normal and pathologic pregnancies. We investigated the possible diagnostic applications of the detection and measurement of cell-free fetal DNA by comparing quantities found in women with ectopic (EP) or intrauterine (IUP) pregnancies. METHODS: We collected blood samples from 58 women who had positive pregnancy tests and specific complaints and sonographic findings suggestive of EP and from 45 women with confirmed IUP. We performed quantitative real-time PCR analysis of the sex-determining region Y (SRY) gene to detect and measure the amount of cell-free fetal DNA. The diagnosis of EP was confirmed by histologic examination. RESULTS: SRY was detected in 15 EP and 14 IUP cases. The mean (SD) amount of cell-free fetal DNA was significantly higher (P<0.005) in women with EP [565 (136) genome-equivalents (GE)/mL] than in women with IUP [72 (19) GE/mL] at the same gestational age. CONCLUSIONS: Our results confirm that cell-free fetal DNA is present in plasma of women with EP. The finding of higher amounts of cell-free fetal DNA in EP cases than in IUP cases suggests that this method might be useful for early diagnosis of EP.     

结合性能验证实验分析尿白蛋白室间质评结果

目的通过检测系统性能验证,分析尿白蛋白室间质评成绩不满意的可能原因及是否影响临床样本检测。 方法回顾室内质控结果,检查仪器及试剂状态;复检剩余的EQA质控样本;对于透散比浊法、散射比浊法检测尿白蛋白进行分析测量范围验证（EP6-A）;检测40份患者尿液样本,对于透射比浊法、散射比浊法检测准确度差异进行分析（EP9-A2）;分析CAP尿液能力验证实验结果,与其他实验室进行临床样本比对。结果室内质控均在控,复测结果与上报结果一致,分析测量范围分析显示两个方法没有显著差异,两种方法检测患者新鲜尿标本差异在允许误差范围内;两次CAP质评回报满意（PT=100%）,两种方法间无明显差异;与其他实验室两次比对偏奇在1/2PT范围内。 结论本实验室透散比浊法、散射比浊法检测尿白蛋白尿白差异小,准确度好,室间质评成绩不影响临床样本的检测质量。