视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的　探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法　分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果　培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）;Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。     

同化培养液双界面法培养纯化的视网膜神经节细胞

视网膜神经节细胞 (ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ ,ＲＧＣｓ)具有高度分化性 ,生后一般不再进行有丝分裂 ,ＲＧＣｓ体外培养属于原代培养 ;ＲＧＣｓ体外混合培养多能存活 4周 ,而纯化培养大多只能存活 4 8ｈ。我们采用星形胶质细胞同化培养液双界面法培养纯化的ＲＧＣｓ存活时间≥ 2周 ,为纯化ＲＧＣｓ提供较好的实验模型。一、材料和方法1 乳鼠脑源性单层星型胶质细胞的培养[1] :取生后 1～5ｄ的Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ(ＳＤ)乳鼠 (清洁级 ,华中科技大学同济医学院动物实验中心提供 ) 5只 ,断头处死 ,取额顶叶脑组织置于…     

视网膜神经节细胞的培养

视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｓ，ＲＧＣｓ）是青光眼性视神经病变的主要损害细胞。近年来发展起来的ＲＧＣ培养技术为揭示其损害机制提供了１条有效途径。因此，我们需了解获得ＲＧＣｓ悬液最普遍的视网膜完全消化法及部分消化剥脱法，以及如何对ＲＧＣｓ进行分离、培养及鉴定技术。在作ＲＧＣｓ培养前需对培养皿、培养瓶等进行处理，常覆以聚－Ｌ－赖酸或预先培养的单层胶质细胞。在细胞鉴定方面，采用荧光逆行标记和Ｔｈｙ－１单克隆抗体免疫组化及细胞内电记录等方法。Ｔｈｙ－１单克隆抗体、板层素（ｌａｍｉｎｉｎ）、神经生长因子（ｎｅｕｒｏｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ＮＧＦ）、ａ－纤维母细胞生长因子（ａ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ａＦＧＦ）等，对培养ＲＧＣｓ有一定影响。     

视网膜神经节细胞的体外培养方法

近年来，视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGCs）体外培养体系不断完善，为进一步体外研究奠定了良好的基础。现对RGCs的各种体外培养方法，以及RGCs的纯化、鉴定和活性判定等项技术综述如下。 （中华眼底病杂志，2002，18：82-84）     

视网膜神经节细胞体外培养、纯化及生物学特性研究

目的 建立体外视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）培养和纯化模型。方法 出生后１－３天Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）乳鼠,ＲＧＣｓ在ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）培养基中培养,相差显微镜下观察细胞生长规律。羊抗鼠单克隆抗体ＦＩＴＣ－Ｔｈｙ－１,１鉴定ＲＧＣｓ并通过Ｔｈｙ１．１单抗进行ＲＧＣｓ的分离纯化,四唑盐（ｍｏｎｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ,ＭＴＴ     

共培养系统中巨噬细胞对大鼠视网膜神经节细胞存活和轴突再生的影响

目的 观察体外巨噬细胞对视网膜神经节细胞（RGC）存活和生长的影响.方法 采用Transwell小室建立大鼠腹膜腔巨噬细胞和RGC的共培养模型,以不用巨噬细胞共培养的RCC作为对照组,用台盼蓝染色计数及相差显微镜观察RGC存活的时间,并测量培养1 d、3 d和5 d时RGC突起的平均长度,进行组间比较.结果 培养1 d、3 d、5 d和7 d,共培养组平均活细胞数分别为（35.50±2.92）个、（28.20±3.36）个、（18.70±3.95）个和（8.80±1.55）个,对照组为（36.20±2.35）个、（27.10±2.96）个、（15.80±3.04）个和（8.40±2.01）个,两组之间差异均无统计学意义（t=0.369、0.497、0.487、2.854,P均〉0.05）.培养1 d、3 d和5 d,共培养组RGC突起的平均长度分别为（19.79±3.98）μm、（68.30±4.07）μm和（95.51±6.51）μm,明显长于对照组[（15.28±1.28）μm、（58.18±4.22）μm和（82.61±3.75）μm],两组差异均有统计学意义（t=-4.562、-6.554、-7.027,P均〈0.05）.结论 巨噬细胞可明显促进共培养     

大鼠视网膜神经细胞的培养

建立视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）的体外培养方法,为ＲＧＣｓ的体外实验研究奠定基础。方法采用胰酶消化将１６只生后２－３天的Ｓｐａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠视网膜制成细胞悬液后,接种于涂以鼠尾胶原的２４孔培养板,预先置入１ｃｍ＊１ｃｍ的载玻片。     

重组人促红细胞生成素对离体培养视网膜神经节细胞的影响

目的研究重组人促红细胞生成素（recombinant humanerythropoiain，rhEPO）对培养的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）存活、突起生长及生长相关蛋白43（growth associmed protein43，GAP-43）表达的影响，探讨rhEPO对培养RGCs可能的作用机制。方法分别用DMEM及含有rhEPO的DMEM对RGCs进行离体培养，观察RGCs在体外存活的时间，测量2d、4d、6dRGCs的最长突起长度；免疫细胞化学检测GAP-43蛋白表达，并测定平均灰度值。结果DMEM组离体培养RGCs于6～8d死亡，而rhEPO组RGCs能存活10～12d，存活时间较DMEM组显著延长（P〈0．01）。培养2d、4d、6d时，DMEM组最长突起长度依次为（42．90±4．71）μm、（79．74±8．49）μm、（110．02±10．79）μm，rhEPO组依次为（55．47±7．07）μm、（100．16±7．78）μm、（118．63±11．50）μm，培养2d、4d时rhEPO组与DMEM组相比差异非常显著（P〈0．01），6d时差异显著（P〈0．05）。2组细胞在培养2d时GAP-43蛋白的表达水平较高，4d时GAP-43蛋白表达到高峰。6d时GAP-43蛋白的表达水平明显降低。各时间点rhEPO组RGCsGAP-43蛋白的表达均较DMEM组有明显增高，与DMEM组相比均有非常显著差异（P〈0．01）。结论rhEPO可延长离体培养RGCs的存活时间和促进其突起的生长。上调离体培养RGCs GAP-43蛋白的表达。rhEPO促进RGCs突起生长的作用可能通过上调RGCs GAP-43蛋白的表达来实现。[眼科新进展2007；27（3）：138-192]     

蛇毒神经生长因子对体外培养鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的研究蛇毒神经生长因子（venom nerve growth factor，vNGF）对离体培养的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的存活和轴突再生的影响。方法采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术，加入不同浓度的vNGF，通过检测细胞的活力选择一个最佳浓度进行培养，行抗Thy-1．1免疫细胞化学染色，观察RGCs在体外的存活时间,比较实验组和对照组的RGCs个数、胞体直径和轴突长度。结果vNGF的最佳浓度是80μg.L，用该浓度作用于细胞，实验组与对照组细胞存活时间分别为13～14d和7～8d，轴突长度分别为（111.78±10.65）μm和（78.73±8.23）μm。阳性细胞个数分别为（224.23±3.83）个和（182.47±2.79）个。结论vNGF能促进体外视网膜神经细胞和RGCs的存活以及轴突的伸长，有视神经保护作用。     

新生SD大鼠视网膜神经节细胞体外原代培养

目的:建立简便易行的新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外原代培养方法。方法:取出生后24h的SD大鼠视网膜,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,接种于多聚赖氨酸包被的预先置入盖玻片的24孔培养板中培养,倒置相差显微镜观察细胞生长规律,使用Thy-1mAb免疫细胞化学法鉴定RGCs。结果:该方法培养的RGCs体外存活时间可达5d,免疫细胞化学法显示RGCs的纯度约为80%。结论:使用不添加附加成分的普通培养液SD大鼠RGCs体外培养成功,且RGCs较纯化,是一种较理想的细胞培养实验模型。     

睫状神经营养因子对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞突起再生的影响

目的观察睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）突起再生的影响。方法取新生SD大鼠视网膜，消化并利用筛网纯化后接种于96孔板，加入不同浓度（10μg·L-1、20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1）CNTF作为实验组，不加CNTF作为对照。根据细胞形态及免疫细胞化学的方法鉴定细胞，观察RGCs生长规律，观测随机选取视野下的RGCs数和有突起细胞数（400倍荧光显微镜和相差显微镜）。结果 纯化的RGCs在含体积分数20％胎牛血清DMEM培养液中可存活30d。加入CNTF后3~5d，40μg·L-1组突起率显著高于对照组（P〈0.05）。7~15d，20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1组突起率显著高于时照组（P〈0.05），30μg·L-1、40μg·L-1组突起率显著高于10μg·L-1、20μg·L-1组（P〈0.05）。结论CNTF能显著促进RGCs突起再生，CNTF的浓度和突起率存在量效关系，一定浓度范围内．高浓度CNTF可较早促进突起再生。     

视网膜神经节细胞多种培养方法的实验研究

目的探讨视网膜神经节细胞（ＲＧＣｓ）的多种培养方法。方法（１）在涂有鼠尾胶原的器皿上通过调整培养液培养：①乳鼠混合及纯化的ＲＧＣｓ；②单层星型胶质细胞上种植纯化的乳鼠ＲＧＣｓ；③引产胎儿混合ＲＧＣｓ。（２）检验鼠尾胶原及中脑顶盖提取液（Ｔｅ）对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的影响。结果（１）混合培养的乳鼠及引产胎儿ＲＧＣｓ大多能存活２周以上；（２）纯化的乳鼠ＲＧＣｓ大多能存活４８ ｈ；（３）单层星型胶质细胞上种植的纯化乳鼠ＲＧＣｓ能存活４周以上；（４）鼠尾胶原及Ｔｅ对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的贴壁及生长有明显的促进作用。结论通过调整培养液及改善微环境能用多种方法培养ＲＧＣｓ。     

壳聚糖对分层及纯化培养的视网膜神经节细胞生长的促进作用

目的 研究壳聚糖对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)生长的影响.方法 取SD乳鼠视网膜,将视网膜分为内层、外层及全层后,分别制成细胞悬液,各自进行培养.实验组加入含100g· L-1壳聚糖的培养基,对照组不加壳聚糖.每天观察细胞生长状态,用MTT比色法检测细胞存活率(OD值).各层细胞分别用Thy1.1抗体鉴定RGC,计算各层细胞的RGC率.两步法提纯RGC,提纯后分别加入含体积分数10％血清、100g· L-1壳聚糖及鼠神经生长因子的培养基,观察细胞生长状态.结果 分层培养细胞的存活率:各层细胞培养后1d、2d存活率最高,MTT比色法结果显示:培养1d后外层OD值为1.189±0.158,内层为1.084±0.150,全层为1.381±0.089;随着培养时间的延长,细胞存活率逐渐降低(P＜0.05):外层OD值3d为0.835±0.120、4d为0.805±0.116、5d为0.782±0.107;内层OD值:3d为0.388±0.095、4d为0.371±0.084、5d为0.347±0.052;全层OD值:3d为0.523±0.047、4d为0.340±0.084、5d为0.227±0.057;相同时间点实验组(壳聚糖组)比对照组(不含壳聚糖)的存活率高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).经细胞免疫组化鉴定,内层RGC％最高(19.248±0.999)％,其次为全层(4.986±0.635)％,外层最低(0.748±0.177)％.两步法提纯神经节细胞:提纯率可达95％以上.纯化的神经节细胞培养2d后测量最大轴突长度,壳聚糖组:62.5 μm、NGF组:37.5 μm、空白对照组:12.5μm,壳聚糖组及NGF组轴突均比对照组长.结论 混合培养的各层细胞中,内层细胞的节细胞率最高.在混合培养的各层细胞中加入壳聚糖,能促进其生长并提高存活率.加入壳聚糖或鼠神经营养因子后,能促进纯化的RGC的生长.     

B族维生素对体外培养大鼠视网膜神经细胞及节细胞的神经营养作用

目的评价维生素B1、B6、B12及其衍生物甲钴胺对视网膜神经细胞及神经节细胞(RGCs)的生存和轴突再生伸长的影响。方法采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术，与不同浓度的B族维生素共同培养，MTT比色法检测细胞活力，进行HE染色和抗Thy1免疫细胞化学染色，测量视网膜神经细胞和RGCs轴突长度，比较各种维生素对细胞轴突伸长的影响。结果维生素B1、B6、B12和甲钴胺的最有效作用浓度分别为100、100、1．0、1．0μmol／L；高密度培养该营养作用更明显。用该浓度作用于细胞，维生素B6、B12和甲钴胺可促进视网膜神经细胞和RGCs轴突伸长。结论B族维生素在体外短期内能够显著提高视网膜神经细胞和RGCs的活力，促进上述细胞轴突再生伸长。     

酸性成纤维细胞生长因子及其改构体对培养大鼠RGCs存活与生长的影响

目的 观察不同质量浓度aFGF、MaFGF对培养的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)生长的影响,及aFGF的神经保护活性是否依赖促有丝分裂活性.方法 用不同质量浓度的aFGF和MaFGF培养RGCs.免疫细胞化学染色,计数免疫阳性细胞,计算轴突生长细胞百分率,MTT法进行检测.结果 培养第3 d,大部分存活细胞为Thy-1免疫细胞化学反应阳性,5 d、7 d后逐渐减少.实验组存活时间3～4 d;培养第3 d,MTT法见各组A值与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),培养第5 d、7 d,差异有统计学意义(P＜0.01);培养相同天数不同质量浓度的aFGF及MaFGF比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);相同质量浓度的aFGF各组与MaFGF各组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 aFGF、MaFGF均能促进培养大鼠RGCs的存活,并延长其存活时间;aFGF保护及促进RGCs存活的作用不依赖其有丝分裂活性.     

神經營養因子對混合培養鼠視網膜神經節細胞的影響

目的觀察兩種神經營養因子腦源性神經營養因子BDNF和碱性成纤維生長因子bFGF對混合培養鼠視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的影響,并節選出其有效濃度.方法采用胰酶消化法將12衹生後2～3天的Sprague-Dawley(SD)乳鼠視網膜制成細胞悬液,接種于鼠尾原包被的96孔培養板(5×104個細胞/孔).分别加入各種濃度梯度的BDNF和bFGF,在37℃、5%CO2恒温培養箱中培養,于1、3、5天,用MTT微量自動比色法測量存活細胞的吸光度A值.用Thy-l抗體、NSE抗體和GFAP抗體進行細胞免疫化學檢查以鍳定RGCs.結果培養在鼠尾原上的細胞生長良好,大部分伸出突起.培養1天、3天,各種濃度的BDNF和bFGF實驗組吸光度A值舆對照組比較均具有顯著性差异(p<0.01,p<0.05);培養5天,BDNF(40ng/ml、50ng/ml)、bFGF(15ng/ml)和BDNF+bFGF組吸光度A值高于對照組,具有顯著性差异(P＜0.01,P＜0.05).結論各種濃度的BDNF和bFGF均能促進鼠RGCs在體外的存活,BDNF具有濃度依賴性,BDNF的作用優于bFGF;同時應用BDNF和bFGF無叠加作用.     

Protective effect of Lycium barbarum polysaccharide on retinal ganglion cells in vitro

AIM: To observe the effect of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on rat retinal ganglion cells (RGCs) in vitro. METHODS: Retinal cells of neonatal Sprague-Dawley rats were collected 1 to 3 days after birth, and co-cultured with different concentrations of LBP for 24 hours. Absorbance values (OD) were recorded using MTT assay for calculating survival rates. RESULTS: All the test groups had protective effects on RGCs. The group with 10mg/mL concentration of LBP had the most significantly difference of OD value compared with that in control group (P<0.01). CONCLUSION: LBP can increase the survival rate and promote the growth of mixed cultured rat RGCs.