用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的 建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法 采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗,利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究。结果 筛选出4株抗LDHpf单抗,间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应,而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western-blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%。结论 GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法。方法 用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力。用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG₁,亲和常数(κ)介于1×10^-8~2.82×10^-10。以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒。     

自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原的评价

目的对自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP—Ⅱ）的敏感性、特异性、稳定性等技术参数进行评价，为试剂盒的临床应用提供科学依据。方法对试剂盒的敏感性、特异性、灵敏度、精密度、稳定性等性能指标进行测定，并与国外的同类试剂盒进行比较研究。结果自制试剂盒操作简便．反应快速；以血涂片显微镜检查为金标准，对49例恶性疟血样、30例间日疟血样、43例正常人血样检测的敏感性为98％，特异性为100％；对恶性疟原虫血样的最小检出量为原虫密度0．01％，对重组HRP—Ⅱ蛋白的最小检出量为10ng／ml；试剂盒精密度和稳定性均较好；各项性能指标相当或优于国外同类试剂盒。结论自行研制的恶性疟原虫免疫层析检测试剂盒测定结果较为准确、稳定和可靠，适用于恶性疟的快速诊断、流行病学筛查、疟区献血员筛查及过境边民筛查。     

胶体金免疫层析试纸检测乙型肝炎病毒表面抗原的评价

目的：对四种胶体金免疫层析测定（GICA）试纸条检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）进行评价，以此为实验室选择提供依据。方法：采用GICA法和酶免疫（ELA）法对定值的HbsAg样品和1210份病人血清标本同时测定，测定其敏感性、特异性和物理特性。结果：四种GILA对表面抗原的最小检出量为1－5ng/ml。与ELA法比较检出率为92．7％－99．1％，未发现假阳性及前带现象。结论：GICA检测血清中HbsAg敏感性低于ELA法，成本较高，但特异性强，简便快速，无需特殊仪器设备，适用急诊和献血员的现场采血前的筛选，有一定的应用价值。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

GICA法检测乙肝病毒标志物“两对半”的结果分析

目的 用ELISA法作参照，对胶体金免疫层析测定(GICA)试纸条检测乙肝标志物表面抗原(HBsAg)、表面抗体(HBsAb)、e抗原(HBeAg)、e抗体(HBeAb)、核心抗体(HBcAb)俗称“两对半”的性能、结果等技术参数进行了分析比较，为GICA法的临床应用提供参考。方法 从ELISA法测定“两对半”的血清标本中选出40例不同反应模式的标本及卫生部临介值血清，用GICA试纸条进行测定，对其反应的特异性，敏感性，符合度及试纸的反应阳性强度进行观察比较分析。结果 与ELISA法比较，GICA法测定血清标本的总特异性为93．8％；总灵敏度为94．4％：总符合率为94％。用GIcA法对卫生部临介值血清HBsAg2ng／ml、HBsAb30mlu／ml、HBcAb2ncu／m检出结果均为弱阳性，HBeAg2ncu／ml为阳性，HBeAb4ncu／ml为阴性，HBsAglng／ml为阴性．而将五项的原有浓度稀释一倍时均为阴性。两种方法检测各种模式符合率为80％。结论 GICA法用于两对半检测其特异性、敏感度、及符合率均达到90％以上，但灵敏度总体低于ELISA法，对于献血员的筛选有漏检的可能。在检测下限的标本有假阴性和假阳性出现，其试剂质量还有待于进一步提高和规范。但GICA法具有快速、简便、特异、不需特殊设备、适用于急诊病人检测的要求及可以单份测定等优点，其应用前景十分广阔。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

聚合酶链反应检测疟疾的研究

目的 建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法。方法 根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列,设计合成两对引物,采用PCR技术,检测89份门诊“四热”病人血样,并与镜检法进行比较研究。结果 恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带,间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带,PCR检测的阳性率为74.16%,镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%。结论 PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法,对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的间日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值。     

疟原虫胶体碳试纸条的研制

目的建立一种简单、灵敏的疟疾诊断方法,并能对疟原虫感染进行定量分析。方法运用双抗体夹心免疫层析法,胶体碳标记间日疟原虫乳酸脱氢酶(Pv-LDH)和恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(Pf-HRP2)特异抗体,与疟原虫相应抗原结合,胶体碳抗原抗体复合物被NC膜上包被的疟原虫特异性抗体捕获并显色。曲线拟合疟原虫抗原浓度与对应的检测带灰度值,选取相关系数最高的拟合方程式。检测不同贮存条件的试纸条灵敏度稳定性,确定最佳保存条件。检测疟疾病人及健康人全血,判断试纸条与镜检法相比较的特异性、敏感性、符合率。结果成功制作了间日疟原虫和恶性疟原虫胶体碳标记特异抗体试纸条,灵敏度分别为5、2.5 ng/ml;检测线性范围分别为5~500 ng/ml、2.5~500 ng/ml。检测带灰度值与疟原虫抗原浓度呈正相关,可对疟原虫感染定量分析。4℃保存6个月后,灵敏度基本不变。与镜检法比较,试纸条的敏感性、特异性、符合率在95%以上。结论疟原虫胶体碳试条操作简便、快速,敏感性和特异性高,适合疟疾的快速定量诊断。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

OBJECTIVE: To prepare a monoclonal antibodies (mAbs) against glutamate dehydrogenase (GDH) of Plasmodium falciparum (FCC1/HN strain) and establish colloidal gold-immunochromatographic assay (GICA) for diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. METHODS: Recombinant GDH was used to immunize Balb/C mice and the mAbs against GDH were prepared using hybridoma technique followed by identification of IgG isotype and its affinity. Protein-G affinity chromatography was employed to purify the antibodies, which were labeled with colloidal gold for establishment of GICA for Plasmodium falciparum detection. RESULTS: Six mAbs were obtained and identified as IgG1(kappa) of IgG isotypes with affinity constants (Kaff) ranging from 1 x 10(-8) to 2.8 x 10(-10). GICA had a sensitivity of 86.66%; and specificity of 96.43%; for Plasmodium falciparum detection compared with routine microscopic examination. CONCLUSION: The established GICA is rapid and accurate for Plasmodium falciparum detection with such potential utility as for instant diagnosis of Plasmodium falciparum malaria.     

胶体金层析法检测恶性疟原虫HRPII抗原的应用研究

目的 :建立一种简易快速 ,适于基层或流行病学调查的自测式胶体金免疫层析法 (GICA)用于检测恶性疟原虫中 H RPII抗原 ,判定是否现症感染。方法 :用 GICA测试条检测全血及滤纸血样中的 H RPII抗原。结果 :40例恶性疟全血及滤纸血 H RPII抗原阳性检出率均为 1 0 0 ,与镜检结果相符合 ;2 5例间日疟均为阴性。结论 :GICA检测血中恶性疟原虫 H RPII抗原特异性强、灵敏度高、简便快速 ,无需特殊仪器设备 ,滤纸血的应用使样本的采集、保存和运输更为便利 ,适合大规模流行病学调查和基层使用 ,有广泛应用价值。     

应用抗SjP38的单克隆抗体建立血吸虫感染的胶体金免疫层析检测体系

目的 建立一种检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析方法.方法 将已获得的单抗用protein-G亲和层析纯化,通过间接ELISA测定每株单抗的亲和常数.按改良过碘酸钠标记法,8株单抗标记辣根过氧化物酶(HRP)后进行不同株单抗配对,选出亲和力高、稳定性强的单抗配对组合.胶体金标记株抗体,选择最佳反应模式,建立胶体金免疫层析方法,并对弓形虫感染鼠血样、血吸虫感染前和感染后2、3、、5、6周的鼠血样进行检测.结果 8株抗SjP38单克隆抗体经纯化后纯度达95%以上,其亲和常数介于1×10^-8mol/L～2.82×10^-10mol/L.根据配对实验,1A6与9H6、1A6与9G7、6G12与9H6、6G12与9G7以及9H6与9G7为最佳配对组合.标记1A6、6G12、9H6与9G7这株单抗后筛选出最佳反应模式,即以9G7为包被抗体,包被浓度为2.5μg/μl;当1A6为金标抗体,抗体稀释浓度为1:时,检测效果最佳.对rSjp38的最低检测量为12.5 ng/ml.抗检测感染3、、5、6周小鼠血清,阳性率分别为0%、50%、60%、80%,而弓形虫感染鼠和血吸虫感染前小鼠血样的检测结果为100%阴性.结论 通过抗体配对、最佳包被量和金标抗体稀释倍数条件的优化,建立了快速、简便、特异的胶体金免疫层析方法,自制的rSjP38试纸条能检测血吸虫早期感染鼠血清中的循环抗原SjP38.     

应用抗SjP38的单克隆抗体建立血吸虫感染的胶体金免疫层析检测体系

OBJECTIVE: To establish a colloidal gold immunochromatographic assay (GICA) for detecting Schistosome japonicum (Sj). METHODS: Eight monoclonal antibodies (mAbs) against Sj p38 antigen (1A6, 3C4, 3D12, 6F10, 6G12, 9H6, 9G7 and A5H) prepared previously were purified by protein-G affinity chromatography. The affinity constant (K(aff)) was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. All the mAbs were labeled with horseradish peroxidase by sodium oxidation method and the mAb pairs with high affinity and stability were identified according to their optical density at 450 nm (OD450). Four mAbs (1A6, 6G12, 9H6 and 9G7) were chosen for colloidal gold labeling. GICA was then performed by further optimization of the labeling and the conditions were determined. The sera of mice at different infection stages were examined with GICA dipstick, with the sera collected before infection and those of Toxoplasma gondii-infected mice as negative controls. RESULTS: The purity of the 8 mAbs was higher than 95% with K(aff) ranging from 2.8x10(-10) to 1x10(-8) mol/L. 9G7 coating (2.5 mg/ml) as the capture antibody and detection with 1A6 (diluted at 1:4) as the labeling antibody was determined as the best reaction model. With this combination, the positivity rates of the detection were 40%, 50%, 60% and 80% for mouse sera collected at 3, 4, 5 and 6 weeks after Schistosome japonicum infection, respectively, without positive results for the negative control samples. CONCLUSION: GICA established in this study is characterized by simplicity, rapidity and good sensitivity, and the prepared rSjP38 dipstick can test the circulating antigen SjP38 in early stage of infection.     

两种试剂盒快速检测疟原虫的比较

目的寻找更适合基层和贫困疟区的敏感、特异、快速、廉价的检测疟原虫的方法，比较两种恶性疟金标免疫层析试剂盒的敏感性和特异性。方法采用ACON试剂盒和Paracheck试剂盒对镜检确认的134例疟疾病人血样进行平行检验。结果ACON试剂盒和Paracheck试剂盒分别检测恶性疟84例，阳性均为84例，符合率均为100％；检测间日疟30例，均为阴性，特异性均为100％；检测恶性疟和间日疟混合感染20例，阳性分别为19例，18例，敏感性分别为95％和90％。结论ACON试剂盒胶体金法具有与Paracheck试剂盒ICT法相同的敏感性和特异性，具有操作快速、简便、直观的特点，并且价格便宜，更适合在基层和疟疾贫困地区推广应用。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

逆转录聚合酶链反应检测恶性疟原虫的应用研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测恶性疟原虫的新方法,并用于检测现场采集血样。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,采用RT—PCR技术,恶性疟原虫预期被扩增出359bp特定扩增带。结果 从培养的恶性疟血样和现场采集的恶性疟血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。本检测系统初步显示可检出0．34个疟原虫／出血样,37份现场采集经镜检确诊的恶性疟血样中,36份RT—PCR检测为阳性,1份RT—PCR检测为阴性,阳性符合率为97．35％。结论 RT—PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。