小鼠脊髓损伤标准化重物打击模型的制备及评价

目的以小鼠作为实验动物，采用改良垂直打击脊髓（weight dropping，WD）建立脊髓损伤（spinal cord iniury，SCI）动物模型，为进一步研究SCI机制奠定基础。方法将健康雌性昆明种小鼠180只随机分为4组，每组45只，采用改良WD法应用Impactor model-Ⅱ脊髓致伤仪分别以2．0×2．5g·cm（A组）、2．5×3．0g·cm（B组）、3．0×5．0g·cm（C组）致伤力致伤脊髓；对照组（D组）仅打开椎板，暴露脊髓，不造成SCI。于打击后即刻，6、12h，1、3d，1、2、4、8周对各组小鼠行运动诱发电位（motor evoked potentials，MEP）检测，并行后肢运动功能（Basso mousescale，BMS）评分，HE染色和甲苯胺蓝染色组织学观察。结果神经电生理检查示B组于伤后6h，C组于伤后12h出现N1潜伏期延长，随着时间延长，A、B、C3组潜伏期开始缩短，A组4周趋于正常为（2．40±0．12）ms，与D组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；B组8周逐渐趋于正常为（2．96±0．15）ms，与D组比较差异无统计学意义（P〉0．05），而C组8周仍维持在较高水平（3．76±0．13）ms，与D组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。SCI伤后即刻小鼠均呈现双后肢瘫痪，BMS主评分为0分；伤后前3dBMS主评分接近0分；随后各组BMS评分逐渐上升，A组伤后1周BMS主评分（5．45±0．12）分，B组伤后2周BMS主评分为（5．45±0．15）分，与D组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；伤后8周A组主评分（8．004±0．13）分，B组达（7．50±0.31）分；1周后各实验组组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05），其中C组低于其余各组（P〈0．01）。伤后2周A组BMS副评分为（10．12±0．76）分，伤后8周B组BMS副评分为（9．85±0．55）分，与同时间点D组比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。组织学检查可见C组伤后12h，损伤节段灰质内大片出血灶，炎性细胞浸润，神经元细胞肿胀明显，并出现中央性尼氏小体溶解；随时间推移，神经元细胞数量减少，胶质细胞增生，尼氏小体消失；伤后2周，可见大量胶质细胞增生及空洞形成。B组神经元细胞减少程度及空洞形成均轻于C组，A组最轻，D组除早期可见轻度细胞水肿外，整个观察期内细胞数量无明显改变。结论该模型准确地反映了小鼠脊髓不同程度损伤后的病理生理特点及变化规律，重复性好；可采用重物打击法制作标准小鼠SCI动物模型。     

Nogo抗体治疗脊髓损伤的实验研究

目的探讨Nogo抗体应用于脊髓损伤动物模型中的疗效。方法压迫法制成Wistar大鼠T10脊髓损伤模型共40例，随机分为两组，实验组采用Nogo抗体治疗，对照组注入生理盐水。术后第1天及4、8、12周，对两组动物的双后肢进行躯体感觉诱发电位（somatosensory evoked potentials，SEP）和运动诱发电位（motor evoked potentials，MEP）检查，记录N1及D波潜伏期和波幅；术后第1天及2、4、6、8、10、12周对动物进行Basso Beatlie Bresnahan（BBB）运动功能评分。术后12周处死动物，取出脊髓组织，冷冻切片后进行HE染色和免疫组化染色，观察神经元中丝改变；神经纤维免疫荧光染色观察神经纤维再生情况，并测量染色阳性面积，综合评估脊髓损伤后功能恢复的程度。结果术后第1天及4、8、12周，实验组SEP-N1潜伏期分别为（38．51±0．70）ms、（37．54±0．47）ms、（35．43±0．30）ms、（34．88±0．27）ms，对照组为（38．76±0．33）ms、（38．55±0．49）ms、（36．61±0．38）ms、（36．06±0．20）ms，差异有统计学意义（P〈0．05）。两组SEP-N1波幅及MEP-D潜伏期和波幅、BBB评分的差异均有统计学意义（P〈0．05）。实验组神经纤维免疫荧光染色阳性面积高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），实验组的疗效优于对照组。结论Nogo抗体治疗脊髓损伤能促进神经元的再生，恢复脊髓功能。Nogo抗体的获取比较方便，技术操作简便易行，为其真正应用于临床奠定良好的基础。     

成年大鼠急性脊髓损伤后Rho GTPases的失衡性表达及对轴突再生的影响

目的 观察成年大鼠急性脊髓损伤(SCI)后小G蛋白Rho GTPases Rac、Cdc42和Rho的表达变化及Rho-ROK下游底物MLC的过度磷酸化,探讨哺乳动物SCI后轴突再生过程中生长锥易于萎陷的可能机制.方法 成年SD大鼠36只随机分为SCI4、7、14、21d组,对照组和假手术组共6组,每组6只,SCI组制作Allen's脊髓打击模型并按时序取材,Western印迹检测Rac1、Cdc42和Rho A的表达变化以及MLC磷酸化程度变化,GST Pull down assay 检测RhoA活化程度变化.结果 在SCI后,大鼠脊髓挫伤部位Rac1和Cdc42的表达逐步升高并在第7天达到峰值,之后呈现下降趋势;与之形成对比的是RhoA的表达则无明显变化,但Rho的下游信号通道RhoA-ROK作用底物MLC磷酸化程度却逐步升高;RhoA活性测定则显示GTP-RhoA呈逐步增高趋势. 结论成年大鼠SCI后脊髓中枢轴突再生过程中存在Rho GTPases Rac、Cdc42和Rho的失衡性表达,这可能是外周微环境中吸引性和排斥性因素制约失衡的直接后果;Rho的活性持续异常升高可导致MLC磷酸化程度异常升高.这一变化可刺激肌动-肌球蛋白的收缩性,从而导致大鼠SCI后生长锥的萎陷和再生神经突起的回缩.     

再论脊髓损伤的修复

关于脊髓损伤修复的问题。我在《中国康复医学杂志》和《中华骨科杂志》两次讨论过。2002年12月《Spinal cord》发表了Fawcett对脊髓损伤修复的综述，与我们的观点甚为相似。在此，对这个问题再次进行讨论，供脊髓损伤的研究者参考。     

大鼠钳夹式急性脊髓损伤模型的制备与评价

[目的]建立并评估大鼠钳夹式脊髓损伤模型,为研究急性脊髓损伤的机制及后续治疗提供基础。[方法]40只成年S-D大鼠,随机分为脊髓损伤组和假手术组,脊髓损伤组行T10水平的椎板切除术,并用一动脉瘤夹瞬间释放,造成脊髓的急性挫伤,假手术组大鼠则仅行T10水平的椎板切除,术后进行行为学评价,血清学检测及病理学检查。[结果]脊髓损伤组大鼠术后运动功能评分(BBB评分)低于假手术组大鼠,术后4 h血清TNF-α和IL-6的含量高于假手术组,且两组差异具有统计学意义,病理学检查脊髓损伤组有脊髓实质结构破坏、空洞及瘢痕形成,假手术组未见明显异常。[结论]本研究建立的大鼠急性脊髓损伤模型,能够反映脊髓损伤的病理生理过程,并具有较好的重复性及稳定性,可用于脊髓损伤的研究。     

中枢神经轴突再生与脊髓修复

脊髓损伤 (ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ ,ＳＣＩ)的临床治疗方法 ,大多是姑息性的。脊髓减压、大网膜移植、血管束植入、亚低温治疗、激素应用、对抗继发性缺血损伤和再灌注损伤、钙通道阻断、自由基清除、以及兴奋性氨基酸拮抗等 ,虽然在一定程度上阻止了病情恶化 ,但并不能改变ＳＣＩ的预后。ＳＣＩ的治疗目的 ,主要是防止继发性损伤 ,减少并发症 ,训练患者适应瘫痪状态下的生活和工作。ＳＣＩ后的中枢神经再生 ,一直是医学界研究的重点课题。尤其近 10余年来 ,进展较快 ,有望改变人们对ＳＣＩ的看法[1] 。1　影响中枢神经轴突再生…     

星形胶质细胞活化与脊髓损伤修复

脊髓损伤后星形胶质细胞活化并分泌多种细胞外基质共同组成的胶质瘢痕,是阻碍神经轴突再生的重要因素。星形胶质细胞活化与TGF-β、Rheb-mTOR等信号通路的激活密切相关,并受到细胞外基质中高分子量透明质酸抑制作用的影响。细胞周期调控是近年报道的抑制星形胶质细胞活化、促进轴突再生的重要手段,而降解星形胶质细胞活化后分泌的多种抑制性蛋白,尤其是硫酸软骨素蛋白多糖则早已受到关注。胶质瘢痕对于脊髓损伤的修复是一把双刃剑,因此干预星形胶质细胞活化的时机亦显得非常重要。     

Nestin-LacZ转基因小鼠脊髓损伤动物模型的建立及评价

[目的]建立标准的Nestin-LacZ转基因小鼠脊髓损伤动物模型及评价体系。[方法]采用NestinLac Z转基因小鼠18只,随机分为三组,实验组2个,对照组1个。2个实验组均采用自行研制的啮齿类动物脊髓损伤模型打击器,质量为10 g的打击棒,A实验组用接触直径为2.0 mm的打击棒杆头压迫,压迫时间为3 min(A组,6例);B实验组按照实验设定的高度10.0 mm实施打击(B组,6例);对照组仅行椎板切除,不打击(C组,6例)。分别于术前,术后第1、2、3、4、5、6周进行转基因小鼠BBB运动评分,取出脊髓组织后,行脊髓组织HE染色。[结果]Nestin-LacZ转基因小鼠不同的脊髓损伤模型在各个时间点上BBB评分差异有统计学意义(P0.05),A组在脊髓损伤造模术后2周,后肢功能开始恢复,而B组至术后6周均无后肢功能恢复,对照组无功能障碍。[结论]啮齿类动物脊髓损伤模型打击器采用持续慢性压迫脊髓可成功建立Nestin-Lac Z转基因小鼠稳定、理想的急性脊髓损伤模型。     

脊髓损伤后轴突再生的研究进展

近20多年来，脊髓损伤的研究取得了长足的进步。本文针对损伤脊髓轴突再生情况，综述了细胞移植、神经桥接、细胞因子、脊髓瘢痕及慢性损伤等方面的研究成果。     

脊髓半切损伤模型的制备

目的：建立一种简便易行、稳定可靠的脊髓半切伤动物模型。方法：取大鼠C5-7颈髓阶段，T8—ll胸髓阶段直径1/2脊髓半切。术后不同时间观察脊髓组织学变化，并纪录脊髓神经功能综合评分(CBS)。结果：光镜下半切脊髓远端侧索和灰质神经变性坏死，术后24h、1周实验组CBS评分与假手术组有显著意义(P＜0．05)，且脊髓腹角运动神经元与假手术组比较明显变化，行为表现为大鼠运动和感觉功能障碍。结论：颈髓5—7半切模型死亡率低，安全可靠。     

脊髓牵拉性损伤动物模型的建立

目的：建立大鼠脊髓牵拉性损伤的模型,探讨实验性脊髓牵拉性损伤的病理生理改变及临床意义。方法：双侧椎板切除显露大鼠脊髓的全宽、用模拟神经拉钩特制的牵开器由侧方牵拉脊髓,实现水平方向的脊髓牵拉性损伤,并用磁刺激运动诱发电位和行为学功能试验指标进行综合评价。结果：选用不同的牵拉比率（２０％、３０％和４０％）可以稳定地复制出不同程度的牵拉性脊髓损伤,其神经电生理的改变与行为学功能的改变有相关性。结论：此模     

改良大鼠脊髓损伤模型椎管开窗方法的应用研究

目的 探讨新型改良大鼠脊髓损伤模型椎管开窗方法的实用性。 方法 将40只普通级成年SD大鼠按照随机数字表法分为2组：传统组（20只,采用传统蚕食法椎管开窗进行造模）、改良组（20只,采用椎板揭盖开窗法进行造模）,比较2组切口长度、手术时间、术中出血量及术后死亡率,并于术后不同时间点评价2组大鼠运动功能（basso beattie bresnahan,BBB）评分及HE染色结果判定脊髓功能障碍及造模成功与否。 结果 切口长度、手术时间、出血量及术后28 d死亡率的比较,改良组明显优于传统组,差异具有统计学意义（P<0.05）。2组大鼠术后BBB评分及HE染色结果提示以椎板揭盖开窗法制备大鼠脊髓损伤模型成功率与传统方法比较,差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 改良大鼠脊髓损伤模型椎板开窗相较传统椎管开窗方法有明显的优势,可广泛运用于脊髓损伤基础研究的模型制作。     

一种可控性脊髓爆震伤模型的建立

目的建立实验室条件下的脊髓爆震伤模型,探讨脊髓爆震伤的致伤特点。方法采用单质锰炸药黑索金(RDX)纸壳雷管为爆源,随机取12只家兔,按爆距2、4、8 cm分为3组致伤,同时检测冲击波压强、正压作用时间。另将12只家兔随机分为致伤组和对照组,致伤组家兔按已选定的标准爆距致伤,观察伤后组织学变化。结果爆距2、4、8 cm测得冲击波压强分别为93.4、50.4、33.5 MPa,爆距4 cm时可造成双后肢运动诱发电位(MEP)潜伏期延长1.0 ms或波幅下降50%,而不致家兔死亡。病理学显示脊髓脊髓前角神经元出现明显坏死,髓鞘板层结构紊乱。结论本方法建立的可控性脊髓爆震伤模型简单、安全、有效,适用于实验室条件下的爆震伤研究。     

改良大鼠脊髓损伤模型椎管开窗方法的实验研究

目的 探讨新型改良大鼠脊髓损伤模型椎管开窗方法的实用性.方法 将40只普通级成年SD(Sprague-Dawley)大鼠按照随机数字表法分为两组:传统组(20只,采用传统蚕食法椎管开窗进行造模)、改良组(20只,采用椎板揭盖开窗法进行造模),比较两组切口长度、手术时间、术中出血量及术后死亡率,并于术后不同时间点评价两组大鼠运动功能(basso beattie bresnahan,BBB)评分及HE染色结果判定脊髓功能障碍及造模成功与否.结果 切口长度、手术时间、出血量及术后28 d死亡率的比较,改良组明显优于传统组,差异均有统计学意义(均P<0.05).两组大鼠术后BBB评分及HE染色结果提示以椎板揭盖开窗法制备大鼠脊髓损伤模型成功率与传统方法比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论改良大鼠脊髓损伤模型椎板开窗相较传统椎管开窗方法有明显的优势,可广泛运用于脊髓损伤基础研究的模型制作.     

一种新型脊柱撑开器的研制及脊髓牵张性损伤动物模型的建立

目的研制一种新型脊柱撑开器并以此建立大鼠脊髓牵张性损伤模型,为脊髓牵张性损伤机制及治疗研究提供可靠的动物模型。方法在既往研究基础上制备一种新型脊柱撑开器。取成年SD大鼠60只,体重250～300 g,随机分为A、B、C、D、E 5组,每组12只。暴露T12～L3脊柱后方结构,咬除T13～L2棘突椎板,显露脊髓。A组仅安放脊柱撑开器,不撑开。B、C、D、E组大鼠,将脊柱撑开器固定于T12～L3椎体横突上,同时行体感诱发电位(somatosensory evoked potential,SEP)监测,其中B、C组脊髓牵张SEP P1下降50%后分别持续5、10 min,D、E组脊髓牵张SEP P1下降70%后分别持续5、10 min,制备T13～L2脊髓牵张性损伤模型。术后1、7 d各组取6只大鼠采用改良Gale联合评分(ICBS)标准进行行为学评分,然后处死大鼠取脊髓行大体观察及HE、尼氏染色,并计数神经元。结果术后1、7 d,A组ICBS评分均为0分,其余各组与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);D、E组ICBS评分显著高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后1 d B、C、D、E组脊髓表面见不同程度水肿、充血,正常结构形态破坏;7 d时脊髓表面无光泽,与周围组织有不同程度粘连,在牵拉中心段可见硬膜凹陷,均以E组最明显。术后1、7 d B、C、D、E组部分神经元坏死、溶解,尼氏体溶解或消失;7 d时神经元数量随损伤程度加重而逐渐减少,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05),且B、C、D、E组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 新型脊柱撑开器成功制备了不同损伤程度的大鼠脊髓牵张性损伤模型,脊髓牵张SEP P1下降70%持续10 min更符合脊髓牵张性损伤实验研究的需要。     

An ovine model of spinal cord injury

Objective: To develop a large animal model of spinal cord injury (SCI), for use in translational studies of spinal cord stimulation (SCS) in the treatment of spasticity. We seek to establish thresholds for the SCS parameters associated with reduction of post-SCI spasticity in the pelvic limbs, with implications for patients.

Study Design: The weight-drop method was used to create a moderate SCI in adult sheep, leading to mild spasticity in the pelvic limbs. Electrodes for electromyography (EMG) and an epidural spinal cord stimulator were then implanted. Behavioral and electrophysiological data were taken during treadmill ambulation in six animals, and in one animal with and without SCS at 0.1, 0.3, 0.5, and 0.9?V.

Setting: All surgical procedures were carried out at the University of Iowa. The gait measurements were made at Iowa State University.

Material and Methods: Nine adult female sheep were used in these institutionally approved protocols. Six of them were trained in treadmill ambulation prior to SCI surgeries, and underwent gait analysis pre- and post-SCI. Stretch reflex and H-reflex measurements were also made in conscious animals.

Results: Gait analysis revealed repeatable quantitative differences in 20% of the key kinematic parameters of the sheep, pre- and post-SCI. Hock joint angular velocity increased toward the normal pre-injury baseline in the animal with SCS at 0.9?V.

Conclusion: The ovine model is workable as a large animal surrogate suitable for translational studies of novel SCS therapies aimed at relieving spasticity in patients with SCI.     

雪旺细胞悬液植入成鼠正常脊髓

目的：了解雪旺细胞（ＳＣ）促进脊髓受损轴索再生作用。方法：将Ｗｉｓｔａｒ大鼠２０只随机分为两组,各１０只,实验组将自成鼠坐骨神经培养获取的雪旺细胞悬液（ＳＣＳ）采用显微注射植入成鼠正常胸段（Ｔ７）脊髓,对照组以相同量的Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良细胞培养液（ＤＭＥＭ）植入。移植术后２周、６周通过组织学及免疫组织化学检查,观察移植物的存活及促进轴索再生能力。结果：实验组宿主中ＳＣ形态正常,束状排列,轴索可长入移植物中。束状排列的ＳＣ间有髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）阳性纤维存在,相伴随的ＳＣ胞质亦呈ＭＢＰ阳性。对照组无再生轴索长入。结论：ＳＣ植入成鼠正常脊髓后,与宿主融合好,可存活,促进宿主再生轴索越过宿主－移植物交界面长入移植物,并形成髓鞘。     

同种胚胎脊髓移植物对成年大鼠损伤脊髓组织形态与功能的修复作用

探讨大鼠胚胎脊髓组织移植物对成年大鼠损伤脊髓组织形态与功能的修复作用。在半切洞损伤的成年大鼠脊髓内，植入大鼠胚胎脊髓组织，术后行联合行为记分、诱发电位及组织学检查。结果：移植物能在宿主脊髓损伤部位存活，并能生长、分化、修复宿主脊髓的组织损伤，诱导宿生神经纤维联系的重建，改善宿主损伤脊髓的神经传导，促进功能恢复。以上结果提示：胚胎脊髓移植物对成年大鼠损伤脊髓组织形态与功能均具有修复作用。