MiR-129-5p靶向抑制高迁移率族蛋白B1表达增加甲状腺髓样细胞MZ-CRC-1放射敏感性的实验研究

目的 探讨miR-129-5p靶向抑制高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对甲状腺髓样细胞MZ-CRC-1放射敏感性的影响机制。方法 建立抗辐射细胞株MZ-CRC-1/R;克隆形成实验分析细胞存活分数;qRT-qPCR检测miR-129-5p在MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R细胞中的表达;噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光酶报告基因实验验证miR-129-5p与高迁移率族蛋白B1（HMGB1）之间的靶向关系;Western blot检测HMGB1和p-AKt的蛋白表达。结果 与MZ-CRC-1细胞相比,MZ-CRC-1/R细胞的细胞存活分数显著提高（t=3.038、4.330、4.885、4.568,P<0.05）;细胞活力增加（t=3.637、7.734、11.896、14.522,P<0.05）;与MZ-CRC-1细胞（1.00±0.06）相比,miR-129-5p在MZ-CRC-1/R细胞中的表达（0.26±0.03）显著降低（t=19.107,P<0.05）;与miR-NC-inhibitor组细胞相比,miR-129-5p-inhibitor组细胞的细胞活力显著增加（t=5.156、6.005、9.649,P<0.05）,细胞凋亡率降低（t=8.659,P<0.05）。与miR-NC组细胞相比,miR-129-5p mimic组细胞的细胞活力显著降低（t=3.118、5.034、6.005、7.488,P<0.05）,细胞凋亡率升高（t=6.362,P<0.05）;过表达miR-129-5p可抑制HMGB1及p-AKt信号通路的表达（t=9.325、10.614,P<0.05）;与miR-129-5p inhibitor组细胞相比,miR-129-5p inhibitor+si-HMGB1组细胞的细胞凋亡率显著升高（t=6.700,P<0.05）;与miR-129-5p mimic组细胞相比,miR-129-5p mimic+si-HMGB1组细胞的细胞凋亡率显著降低（t=7.073,P<0.05）。结论 miR-129-5p可靶向抑制HMGB1增加甲状腺髓样细胞MZ-CRC-1的放射敏感性。     

miR-885-3p靶向AKT1对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响

目的 探究miR-885-3p对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响以及作用机制。方法 荧光定量PCR检测经不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X射线照射后HT-29细胞中miR-885-3p的表达量;建立过表达miR-885-3p细胞株,功能试验探讨其对HT-29细胞放射敏感性的影响;生物信息学预测miR-885-3p下游调控的靶基因,双荧光素酶报告基因法进一步验证;上调和下调miR-885-3p表达量探讨miR-885-3p与靶基因丝苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）表达量的调控关系;慢病毒转染敲减AKT1表达量,观察其对HT-29细胞放射敏感性的影响;共转染miR-885-3p模拟物,探讨过表达AKT1对miR-885-3p诱导的HT-29细胞放射敏感性的影响。结果 miR-885-3p在放射诱导的HT-29细胞中表达上调（F=46.64,P<0.05）;过表达miR-885-3p和敲减AKT1可通过抑制HT-29细胞存活、促进其凋亡,从而增强HT-29细胞放射敏感性（t=12.33、12.95,P<0.05）,放射增敏比（SER）分别为1.602和1.946;抑制miR-885-3p可通过促进HT-29细胞存活、抑制其凋亡从而促进HT-29细胞放射抵抗（t=11.94,P<0.05）,SER为0.839;AKT1是miR-885-3p下游靶基因;过表达AKT1反转miR-885-3p增强HT-29放射敏感性的作用,SER为0.680。结论 miR-885-3p通过直接靶向AKT1增加结直肠癌HT-29细胞放射敏感性,为提高临床结直肠癌放疗敏感性提供一个靶点。     

miR-27b-3p通过靶向PLK2促进乳腺癌细胞的辐射抵抗

目的 研究miR-27b-3p对乳腺癌细胞辐射抵抗的影响。方法 通过检索基因表达（GEO）数据库，筛选分析miR-27b-3p在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达水平。利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同乳腺癌细胞系中的表达水平。通过细胞克隆形成、免疫荧光和5-乙炔基-2''-脱氧尿苷（EDU）检测技术评价miR-27b-3p对乳腺癌细胞辐射抵抗作用。采用荧光素酶报告基因技术确定miR-27b-3p的靶基因PLK2，并在乳腺癌细胞中进一步验证miR-27b-3p的辐射抵抗作用。结果 与正常乳腺组织和细胞相比，miR-27b-3p在乳腺癌组织（t=2.99，P<0.01）和乳腺癌细胞中表达水平显著上调（t=21.21、32.88，P<0.05）。尤其在抗辐射细胞MCF-7R中升高更加明显（t=25.63，P<0.05）。过表达miR-27b-3p增强了MCF-7细胞的克隆形成能力（t=10.32，P<0.05），且随着辐照剂量的增加，miR-27b-3p对MCF-7增殖能力的保护效应逐渐凸显（t=8.77、8.26、8.03，P<0.05）；干扰miR-27b-3p则抑制MCF-7R细胞克隆形成数（t=40.00，P<0.05），且随着辐照剂量的增加，进一步削弱了MCF-7R细胞的增殖能力（t=8.54、8.32、8.23，P<0.05）。报告基因实验结果表明，PLK2是miR-27b-3p的直接靶标。过表达PLK2抑制了miR-27b-3p介导的乳腺癌细胞辐射抵抗（MCF-7：t=9.66，P<0.05；MCF-7R：t=6.42，P<0.05）。结论 miR-27b-3p可通过靶向PLK2提高乳腺癌细胞的辐射抗性。     

低温等离子体联合辐射对三种癌细胞系放射增敏效应的研究

目的 探讨低温等离子体对人肝癌细胞系HepG2、非小细胞肺癌细胞系A549及人宫颈癌细胞系HeLa的放射增敏作用及其机制。方法 应用克隆形成实验观察低温等离子体对3种细胞的放射增敏作用;流式细胞仪分析3种细胞周期分布、凋亡率及活性氧含量;Western blot法检测单纯照射(R组)、单纯等离子体作用(P组)及其联合辐射(P+R组)对3种细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响。结果 低温等离子体对HepG2、A549及HeLa细胞均有放射增敏作用,放射增敏比(SER_D0)分别为1.28、1.32、1.29。HepG2、A549及HeLa细胞P+R组G₂/M期比例、凋亡率及活性氧含量与R组比较均明显增高(t_G2/M期=9.52、8.24、9.53,P<0.05;t_凋亡率=10.67、38.56、6.74,P<0.05;t_{活性氧含量}=9.41、15.42、13.53,P<0.05)。HepG2和A549细胞P+R组G₂/M期比例、凋亡率及活性氧含量与P组比较均明显升高(t_G2/M期=8.75、20.37,P<0.05;t_凋亡率=8.43、9.99,P<0.05;t_{活性氧含量}=4.82、5.27,P<0.05)。3种癌细胞中P+R组Bcl-2蛋白表达较R组降低,而Caspase-3蛋白表达升高。结论 低温等离子体可提高HepG2、A549及HeLa细胞系的放射敏感性,其对HepG2及A549细胞系的放射增敏机制可能与抑制亚致死损伤修复,使细胞周期阻滞在G₂/M期,以及提高细胞内ROS水平诱导细胞凋亡有关。     

lncRNA CCAT1靶向miR-130b-3p对人胰腺癌细胞PANC-1放射敏感性的影响

目的 探讨lncRNA CCAT1和miR-130b-3p对体外培养的胰腺癌细胞PANC-1放射敏感性的影响。方法 采用Real-time PCR检测胰腺癌组织及其细胞系和2 Gy X射线照射后PANC-1细胞中CCAT1和miR-130b-3p的相对表达水平。沉默CCAT1表达、抑制miR-130b-3p表达后,应用流式细胞仪、Caspase 3活性检测试剂盒及克隆形成实验检测细胞凋亡率、Caspase 3活性和细胞存活分数,并绘制单击多靶模型拟合曲线;利用starBase v2.0在线预测、荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀实验（RIP）及Real-time PCR实验,验证CCAT1和miR-130b-3p的靶向关系。结果 在放射抵抗的胰腺癌组织、胰腺癌细胞系和2 Gy照射的PANC-1细胞中,CCAT1表达均上调（t=6.322~8.555,P<0.05）,miR-130b-3p表达下调（t=3.950~18.795,P<0.05）。2 Gy照射并沉默CCAT1,PANC-1细胞存活分数降低（t=2.929、5.047、5.234、5.125,P<0.05）,细胞凋亡率增加（t=6.953,P<0.05）,Caspase 3活性升高（t=6.836,P<0.05）。发现CCAT1能靶向调控miR-130b-3p表达,抑制miR-130b-3p表达,PANC-1细胞存活分数增大（t=4.564、6.736、8.656,P<0.05）,细胞凋亡减少（t=5.234,P<0.05）,Caspase 3活性降低（t=10.440,P<0.05）。结论 沉默CCAT1表达能够促进miR-130b-3p表达,从而增加PANC-1细胞放射敏感性。     

TLR2下游辐射防护关键miRNA筛选及miR-21功能验证

目的 筛选Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）通路下游与辐射防护调控相关的关键miRNA,并探讨miR-21功能。方法 以⁶⁰Co γ射线对野生型（wild type, WT）、TLR2 KO小鼠分别进行6.0、7.0、8.0 Gy全身照射,观察小鼠生存情况;通过转录组测序筛选骨髓细胞内TLR2通路下游关键miRNA,并通过QT-PCR验证其表达。过表达/敲低该miRNA后检测其生物学功能。结果 6.0、7.0、8.0 Gy全身照射后,TLR2 KO小鼠较WT小鼠辐射敏感性增加（χ²=4.490、13.100、7.928,P<0.05）,骨髓移植实验证明TLR2 KO小鼠辐射敏感性增加与照射后骨髓细胞损伤有关（χ²=4.291,P<0.05）。转录组测序筛选到差异基因55个（[log2 Fold Change]>0.95,Q<0.05）,其中上调基因28个,下调基因27个;定量PCR实验确定TLR2 KO（t=9.420,P<0.01）与MyD88 KO（t=10.700,P<0.01）小鼠骨髓细胞内miR-21表达下调。PAM3CSK4刺激后小鼠骨髓细胞内白介素6（IL-6）（t=13.790,P<0.05）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）（t=14.280,P<0.05）表达量上调且依赖于TLR2。miR-21过表达可以促进EL4（t=5.951,P<0.05）和NIH/3T3（t=4.786,P<0.05）辐射后细胞活力,抑制WT小鼠（t=4.842,P<0.05）和TLR2 KO小鼠（t=10.520,P<0.05）BMCs辐射后细胞凋亡。miR-21敲低后降低EL4（t=4.815,P<0.05）和NIH/3T3（t=4.042,P<0.05）辐射后细胞活力。结论 miR-21在TLR2辐射防护进程中具有关键调控作用,其作用机制可能与上调IL-6与TNF-α有关。     

FOXO4-DRI多肽增加非小细胞肺癌细胞放射敏感性研究

目的 探讨FOXO4-DRI多肽对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞放射敏感性的影响。方法 为检测FOXO4-DRI对NSCLC细胞的影响,将H460和A549细胞按照射与给药方式分为对照组、FOXO4-DRI组、单纯照射组、照射+FOXO4-DRI组。采用剂量率为0.99 Gy/min γ射线单次照射,在照射前10 min对H460细胞给予FOXO4-DRI 6 μmol/L,A549细胞给予FOXO4-DRI 30 μmol/L。采用CCK-8法检测照射后24、48和72 h细胞存活率;用结晶紫染色法检测细胞克隆形成数目;用伤口愈合实验检测细胞迁移程度;用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的改变。结果 与对照组相比,FOXO4-DRI组H460细胞和A549细胞存活率降低（t=1.06~50.75,P<0.05）、迁移率降低（t=33.37~139.10,P<0.05）,克隆形成数目减少（t=5.20~93.48,P<0.05）。FOXO4-DRI诱导了细胞凋亡（t=2.95~42.00,P<0.05）,导致G₀/G₁细胞周期阻滞以及G₂/M期细胞比例下降（t=3.50~31.59,P<0.05）。与照射组相比,FOXO4-DRI可进一步降低辐照后的细胞存活率（t=2.94~23.40,P<0.05）,减少辐照后克隆形成数目（t=8.43~34.00,P<0.05）和细胞迁移率（t=5.25、7.56,P<0.05）,增加细胞凋亡（t=9.20~11.52,P<0.05）。照射+FOXO4-DRI组细胞,G₂/M期细胞比例进一步下降,S期细胞增加（t=3.85~17.62,P<0.05）。结论 FOXO4-DRI多肽通过促进细胞凋亡,降低细胞增殖能力和迁移率,可以提高NSCLC细胞放射敏感性。     

lncRNA GAS5通过下调miR-223的表达提高结肠癌细胞的放射敏感性

目的 探究生长特异抑制物5（lncRNA growth arrest-specific 5,lncRNA GAS5）通过靶向调控miR-223的表达对结肠癌细胞的放射敏感性的影响。方法 采用荧光定量PCR（qPCR）检测多种结肠癌细胞系中lncRNA GAS5的表达量,选择表达量较低的作为后续研究对象;细胞克隆实验检测过表达lncRNA GAS5对结肠癌SW480细胞放射敏感性的影响;通过生物信息学数据库starBase以及双荧光素酶报告基因实验预测以及验证lncRNA GAS5的靶基因miR-223;qPCR检测miR-223在多种结肠癌细胞系中的表达量,以及过表达lncRNA GAS5对SW480细胞中miR-223表达量的影响。结果 与人正常结肠上皮细胞（NCM460）相比,lncRNA GAS5在结肠癌SW480、LOVO、HT-29、SW620细胞系中的表达量显著降低（t=15.25、8.69、14.42、11.62,P<0.05）,其中在SW480细胞中的表达量最低;过表达lncRNA GAS5或者下调miR-223显著降低细胞的存活分数（8 Gy时lncRNA GAS5：t=13.51,P<0.05;anti-miR-223：t=14.93,P<0.05）,促进凋亡（lncRNA GAS5：t=8.30,P<0.05;anti-miR-223：t=7.32,P<0.05）,增加结肠癌细胞放射敏感性;生物信息学分析显示,lncRNA GAS5 3''端序列中包含与miR-223的结合位点,过表达/下调lncRNA GAS5后,miR-223的表达量下降/上升。结论 lncRNA GAS5通过靶向调控miR-223的表达促进结肠癌细胞凋亡、抑制其存活,从而提高结肠癌细胞的放射敏感性。     

miR-141过表达增强人食管癌细胞的放射敏感性

目的 研究miR-141对食管癌细胞放射敏感性的影响及可能的作用机制。方法 将miR-141 mimic或miR-对照转染到食管癌KYSE-150细胞中,分别使用qRT-PCR和Western blot技术检测miR-141和增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。CCK-8,流式细胞术及克隆形成实验检测放射处理后细胞的放射敏感性变化。结果 随放射剂量的增加,食管癌细胞中miR-141表达逐渐降低（t=2.57~8.96,P<0.05）。miR-141过表达抑制了细胞的增殖和克隆形成能力,促进了KYSE-150细胞凋亡,使得放射敏感性增高（t=3.24,P<0.05）。此外,与对照组相比,miR-141过表达显著抑制KYSE-150细胞中的Ki67和Bcl-2蛋白表达（t=6.56、8.24,P<0.01）,并促进Bax蛋白表达（t=3.24,P<0.01）,进一步证实了miR-141增强食管癌细胞的放射敏感性。结论 miR-141通过调控细胞增殖和凋亡相关蛋白表达增强食管癌细胞的放射敏感性。     

乙肝病毒X蛋白连接蛋白抑制辐射诱导的乳腺癌细胞自噬调节的研究

目的 探讨乙肝病毒X蛋白连接蛋白（HBXIP）对电离辐射诱导的乳腺癌细胞自噬的影响。方法 将实验细胞分为对照组、HBXIP转染组、si-HBXIP转染组、HBXIP和si-STAT3共转染组。各处理组给予4 Gy γ射线照射后,0、24、48和72 h采用流式细胞技术检测含嗜酸性自噬体的乳腺癌细胞数;Western blot方法检测LC3-I/II、HBXIP、STAT3蛋白和STAT3（Y705）磷酸化蛋白表达水平的改变。结果 与对照组相比,外源性过表达HBXIP明显减少含有辐射诱导的嗜酸性自噬体的乳腺癌MDA-MB-231细胞数（t_{24 h}=3.67,P<0.05;t_{48 h}=9.74,P<0.01;t_{72 h}=10.15,P<0.01）和自噬相关蛋白LC3-II蛋白的表达;相反,采用siRNA降低HBXIP表达则明显增加含有嗜酸性自噬体的细胞数（t_{24 h}=3.5,P<0.05;t_{48 h}=4.15,P<0.05;t_{72 h}=12.12,P<0.01）和LC3-II的表达。提高HBXIP表达导致剂量依赖性的辐射诱导的STAT3（Y705）磷酸化水平提高;反之,降低HBXIP表达可降低受照细胞中STAT3（Y705）磷酸化水平的表达。采用siRNA-STAT3降低STAT3表达水平,明显降低了HBXIP对辐射诱导的自噬（t_{24 h}=5.57,P<0.05;t_{48 h}=13.65,P<0.01;t_{72 h}=12.47,P<0.01）和LC3-I/II表达调节能力。结论 HBXIP可通过调节p-STAT3（Y705）磷酸化的表达从而调节辐射诱导的乳腺癌细胞自噬。     

125I-UdR壳聚糖纳米微粒对肝癌细胞的内照射生物学效应

目的 评估¹²⁵I-UdR壳聚糖载药纳米微粒(¹²⁵I-UdR-CS-DLN)对肝癌细胞的内照射生物学效应.方法 采用激光共聚焦显微镜观察¹²⁵I-UdR-CS-DLN在肝癌细胞HepG2和人正常肝组织细胞HL-7702内的聚积和分布;通过MTT实验、流式细胞仪和单细胞凝胶电泳技术,评价内照射细胞生物学效应;采用TUNEL染色法观察兔肝原位肿瘤细胞经¹²⁵I-UdR-CS-DLN靶向治疗后的细胞凋亡.结果 纳米微粒作用30 min后,其在HepG2细胞质内的聚积大于HL-7702;当¹²⁵I-UdR-CS-DLN浓度大于37 kBq/ml时,HepG2细胞在纳米微粒作用后24、48 h的存活率显著低于HL-7702细胞(t=-4.46~6.31,P<0.05),且细胞周期G₁期阻滞明显, G₂/M期细胞明显受损;¹²⁵I-UdR-CS-DLN造成细胞DNA双链断裂的程度明显高于¹²⁵I-UdR,HepG2细胞的DNA损伤后修复能力显著低于HL-7702(Olive尾矩:t=2.94,P<0.05;彗尾DNA%:t=10.64,P<0.01);兔肝原位癌模型经介入被动靶向治疗后的TUNEL染色结果表明,¹²⁵I-UdR-CS-DLN可使兔肝原位肿瘤细胞产生明显的凋亡,而相同剂量¹²⁵I-UdR作用后肿瘤并未出现明显的凋亡.结论 ¹²⁵I-UdR-CS-DLN进入肝癌细胞的能力明显强于¹²⁵I-UdR,引起的DNA辐射损伤效应更强,可明显加剧肝癌细胞的凋亡,阻止DNA损伤修复.     

miR-124靶向STAT3改善脑恶性胶质瘤细胞辐射敏感性

目的 研究miR-124在放射敏感及耐受的脑恶性胶质瘤细胞LN229和LN229R中的表达以及miR-124对细胞放射敏感性的影响,并深入探讨miR-124调控LN229R细胞放射敏感性的作用机制。方法 将miR-124模拟物（miR-124）及阴性对照（miR-NC）,STAT3过表达质粒（STAT3）及pcDNA3.1质粒（pcDNA）单独或共转染到放射抵抗的胶质瘤细胞LN229R中。qRT-PCR检测LN229和LN229R细胞中miR-124的表达;克隆形成实验分析不同放射剂量下LN229R细胞的生存率以及敏感性相关参数值;流式细胞术分析LN229R细胞的凋亡情况;生物信息学预测miR-124和STAT3的靶向关系,并利用双荧光素酶报告分析加以验证;Western blot分析STAT3的蛋白表达水平。结果 与LN229组（1.02±0.09）相比,miR-124在LN229R细胞中的表达水平（0.32±0.03）显著降低,差异有统计学意义（t=12.780,P<0.05）;与miR-NC组（0.95±0.06）相比,转染miR-124模拟物可促进LN229R细胞中miR-124的表达（4.02±0.39）（t=13.476,P<0.05）;8 Gy照射条件下,miR-124过表达组癌细胞的生存率（0.003±0.000 4）显著低于miR-NC组（0.033±0.005 0）（t=5.655,P<0.05）,细胞凋亡率（22.34±2.42）%显著高于miR-NC组（4.69±0.51）%（t=12.361,P<0.05）;STAT3是miR-124的靶基因;外源回补STAT3可逆转miR-124对LN229R细胞生存的抑制作用。结论 miR-124通过靶向STAT3改善LN229R细胞的放射敏感性。     

塞来昔布对正常脑胶质细胞和脑胶质瘤细胞放射增敏效应的比较及其机制

目的 探讨塞来昔布对正常少突胶质细胞（oln93）及脑胶质瘤细胞（u373）的放射增敏作用及其作用机制。方法 将两种细胞按空白处理、单独接受塞来昔布或X射线、塞来昔布联合X射线4种不同处理方式分为对照组、给药组、照射组和联合组,MTT法、克隆形成法对比两种细胞的增殖和放射敏感性,流式法测细胞的周期分布,Western blot法分析相关蛋白表达。结果 与未加药物相比,塞来昔布能抑制oln93细胞和u373细胞生长（t=2.215~30.996,P<0.05;t=0.383~11.732,P<0.05）,但相同药物浓度下抑制两种细胞差异无统计学意义。放射增敏比SER分别为1.13和1.21,并诱导G₀/G₁期阻滞（t=-6.1~5.141,P<0.05）。联合组与照射组比较,oln93细胞发生S期阻滞（t=-18.174,P<0.05）,CyclinA蛋白表达增加（t=-8.087,P<0.05）;u373细胞发生G₂/M期阻滞,Cyclin B1、DNA-PKcs、MRE11蛋白表达下降（t=-8.838~10.45,P<0.05）。结论 塞来昔布对u373的放射增敏作用比oln93细胞明显,其机制与调节细胞周期分布及DNA损伤修复有关。