大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的研究5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞方向分化的最佳诱导浓度及诱导后细胞的活性,以得到稳定分化的成肌细胞.方法应用不同浓度的5-氮杂胞苷进行定向诱导分化,3H-TdR掺入试验检测诱导后细胞的活性状况,筛选出最佳的时相-浓度结合点,通过免疫组化鉴定分化结果.结果在10μmol/L5-氮杂胞苷诱导培养后15d细胞活性较好,免疫组化技术鉴定其已向成肌细胞方向分化.结论10μmol/L5-氮杂胞苷可成功诱导其向成肌细胞分化.为临床上以细胞注射治疗女性压力性尿失禁提供实验依据.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

体内外环境对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

目的:探讨体内外环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的影响.方法:①DAPI体外标记MSCs后,直接注入大鼠大脑中动脉梗塞(MACO)模型(n=6)的脑内,2周后取脑组织,用免疫荧光检测MSCs来源细胞的巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.②体外用全反式视黄酸(ATRA)预诱导24h后,换用改良的神经细胞培养基(MNM)培养18h,免疫组化检测nestin、MAP-2、GFAP的表达.结果:①植入2周后,MSCs在注射部位及其周围广泛分布,仅有少许细胞表达nestin、MAP-2和GFAP.②MSCs在体外诱导后,nestin、MAP-2的阳性率分别为(92.3±3.4)%和(89.6 3.3)%,但不表达GFAP.结论:MSCs在脑内向神经细胞转化的转化率较低,而在体外转化为神经元的转化率相当高,体内外环境对MSCs向神经细胞的分化的过程及机理存在较大差异.     

剪应力诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：研究剪应力对骨髓间充质干细胞（MSCs）分化的作用.方法：采用平行平板流动腔系统,将人骨髓间充质干细胞在3×10-5,8×10-5,15×10-5N/cm2剪应力水平分别作用24h,观察细胞形态变化,并进行内皮细胞标记物Von Willebrand factor（vWF）定性间接免疫荧光染色,进行Dil标记的乙酰化LDL（Dil-Ac-LDL）摄取实验以鉴定是否具有内皮细胞功能.结果：在剪应力作用24h后,MSCs形态变得偏圆、呈多角形,平行于流体方向排列.MSCs在接受3×10-5,8×10-5N/cm2剪应力作用24h后vWF染色阳性,提示内皮细胞表型特征,同时Dil-Ac-LDL摄取实验阳性,提示具有内皮细胞功能.而接受15×10-5N/cm2剪应力作用的MSCs,vWF染色与Dil-Ac-LDL摄取实验均阴性,提示未出现向内皮细胞分化.结论：剪应力可诱导MSCs向内皮细胞分化,并且与力的大小相关.     

葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖及胰岛素(INs)对骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞(OB)分化能力的影响,探讨葡萄糖及INs对骨代谢的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术自大鼠股骨和胫骨中分离BMSC进行纯化,培养,然后在成骨培养基中诱导BMSC分化为OB,并用不同浓度的葡萄糖(5.6、25、50 mmol/L)及加或不加INs(0.6 μg/ml)干预诱导过程,光镜下观察茜素红染色分化后的OB钙结节的细胞比例.Realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)及转录因子Runx2 mRNA表达.结果 随着糖浓度升高,茜素红染色红色钙结节数目明显减少,PCR结果显示ALP,BGP及Runx2 mRNA表达也明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).提示随着糖浓度增加成骨分化逐渐减少,在同等糖浓度下,加入INs干预组,茜素红染色阳性细胞计数明显增加,PCR结果ALP,BGP及Runx2 mRNA表达明显升高(P<0.01),提示INs可提高OB分化.结论 葡萄糖呈量效性地抑制BMSC向OB分化,这可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一.INs可促进BMSC向OB分化,并可改善高糖对BMSC向OB分化的抑制作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能。 方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以 下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗+单纯输注MSC;实验组2(B组),放疗+输注天麻诱导1h MSC,A、B组每只小鼠注射0.3mL含1.5×106cells的无血清培养液。空白对照组,放疗+输注等量无血清培 养液。照射后4h内,分别经尾静脉注射。移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细 胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45表达。结果:所有实验小鼠均能存活到2个月,骨髓、外周血、脾细胞悬液 均可检测到低表达的大鼠源性CD11a、CD45。对照组为阴性。A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P< 0.05)。结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能。     

低氧对人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

目的 探讨低氧对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经细胞分化的影响.方法 将第2代hBM-SCs进行传代、纯化,取第4代hBMSCs进行流式细胞仪检测鉴定;以含1％ FBS的α-MEM为基础诱导培养基,根据处理条件不同分为4组:常氧对照组、低氧对照组(3％氧浓度)、常氧诱导组[添加20 ng/mL表皮生长因子(E GF)及20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]、低氧诱导组(3％氧浓度下添加20 ng/mL EGF及20 ng/mL bFGF).连续诱导3d后,采用RT-PCR及Western blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在基因及蛋白水平表达变化.结果 第4代hBMSCs流式鉴定结果示:骨髓基质标志CD105、CD90、CD29表达分别为95.8％、98.2％、95.1％,而造血细胞标志CD19表达为0.2％;与常氧对照组比较,低氧对照组NSE、MAP-2、GFAP在基因及蛋白水平表达均无明显改变(P＞0.05),而常氧诱导组及低氧诱导组相应表达均升高(P＜0.05),且低氧诱导组表达高于常氧诱导组(P＜0.05).结论 低氧促进EGF联合bFGF对hBMSCs向神经元细胞及神经胶质细胞分化的诱导作用.     

骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

随着组织工程学的不断发展，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）被研究证明可以诱导分化为多种组织细胞．尤其是在骨组织工程中得到了很好的应用．有望成为骨组织工程重要种子细胞来源。     

小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究

目的:探讨体外诱导犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮样细胞分化的可行性和基本条件.方法:抽取成年健康杂种犬的骨髓,用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化BMSCs,培养扩增后,取第2代BMSCs在以下不同培养液中诱导培养:K-SFM EGF BPE、DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS,观察细胞形态的变化,绘制细胞的生长曲线,诱导培养后第7、14天,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)的表达.结果:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞形态变为圆形或椭圆形,有突起,第14天圆形或椭圆形细胞明显增多;诱导培养过程中DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞形态无明显变化.CK免疫细胞化学染色结果提示:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞呈阳性表达,第14天,阳性细胞明显增多;DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均呈阴性表达.流式细胞仪检测发现K-SFM EGF BPE组诱导培养第14天,部分细胞CK和EMA呈阳性表达(>7%),DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均为阴性.结论:本实验提示K-SFM EGF BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。