柴胡和狭叶柴胡营养器官结构及其化学成分比较研究

目的从营养器官的形态结构及主要药用成分的贮存部位和含量等方面,对柴胡的两种原植物柴胡和狭叶柴胡进行比较研究,探讨其共性与区别。方法采用石蜡切片法观察植物各器官的内部结构、组织化学定位法观察各器官中药有效成分的积累结构和可见光分光光度法测定药效成分的量。结果柴胡和狭叶柴胡营养器官的形态结构比较显示其在形态结构上都存在一定差别。其中,柴胡为异面叶结构,而狭叶柴胡为等面叶结构,有显著差别。组织化学定位表明柴胡和狭叶柴胡中的主要药用成分柴胡皂苷和黄酮类化合物在各营养器官中的积累结构也存在一定差异。植物化学研究表明,狭叶柴胡各营养器官中柴胡总皂苷的量都高于柴胡;而柴胡叶中黄酮类化合物的量则高于狭叶柴胡。结论柴胡和狭叶柴胡形态结构上都存在一定差别。组织化学定位和植物化学检测总皂苷的结果表明《中国药典》规定两种柴胡的药用部位为其干燥根是正确的。同时,它们地上部分含有丰富的黄酮类化合物,提示在采挖其根的同时,可以综合利用其地上部分。     

不同炮制工艺丹皮炭中黄酮类成分的动态变化

目的:研究牡丹皮炮制过程中黄酮类成分的动态变化,探讨丹皮炭的炮制机制.方法:取生丹皮及经不同炒炭工艺制得的丹皮炭,加乙醇50 mL超声30 min 2次,再经聚酰胺柱纯化后采用HPLC,在360 nm波长处,流动相甲醇-0.5‰三氟乙酸水溶液梯度条件下,测定槲皮素、山柰素、异鼠李素等黄酮类成分的含量.结果:丹皮炭中3种黄酮类成分含量随炒制时间的延长而降低,随炒制温度的升高而降低.结论:不同炮制条件对丹皮炭中黄酮类成分的含量影响较大,总体变化趋势是高温长时间导致黄酮类成分含量降低,为进一步研究丹皮炭的止血机制和质量控制提供了依据.     

狭叶柴胡内参基因筛选及皂苷合成关键酶基因组织表达分析

目的筛选适宜狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium组织表达分析的内参基因,分析柴胡皂苷合成关键酶基因的组织表达模式。方法选取Actin、α-tubulin、β-tubulin、Cyclophilin、EF-1α5个常用的内参基因作为候选,分别使用Delta CT、Best Keeper、Norm Finder、ge Norm软件对各候选内参基因的稳定性进行评价,并对候选内参基因的稳定性进行验证,利用实时荧光定量PCR技术,以筛选得到的内参基因分析狭叶柴胡根、茎、叶、果中柴胡皂苷合成关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、SS、β-AS基因的组织表达模式。结果候选内参基因平均表达稳定性由高到低排序为β-tubulinCyclophilinActinEF-1αα-tubulin,β-tubulin是狭叶柴胡基因组织表达分析的适宜内参基因。HMGR基因表达量由高到低为根茎/果叶,IPPI基因表达量由高到低为根茎果叶,FPS基因表达量由高到低为叶根茎果,SS基因表达量由高到低为叶果根茎,β-AS基因表达量高低为叶根果茎,其中HMGR与IPPI及FPS与β-AS基因的表达显著呈正相关(P0.05)。结论筛选得到了狭叶柴胡不同组织基因表达分析的最适内参基因为β-tubulin,为狭叶柴胡基因组织表达分析奠定方法学基础。柴胡皂苷合成关键酶基因有不同的组织表达模式,可能参与调控狭叶柴胡不同组织中柴胡皂苷合成与积累的流向。     

柴胡与狭叶柴胡的特异性引物PCR鉴别方法

目的设计专用于柴胡与狭叶柴胡鉴别的ARMS特异性引物,为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供分子鉴定依据。方法根据柴胡、狭叶柴胡与其他柴胡属植物的r DNA ITS序列,寻找柴胡与狭叶柴胡的序列特异性位点,设计用于进行柴胡与狭叶柴胡分子鉴别的特异性引物。结果该特异性引物为柴胡、狭叶柴胡的鉴别提供了分子鉴定依据,可从多种药材及中成药(蜜丸、水蜜丸)中快速、准确地检测出柴胡、狭叶柴胡。结论运用特异性引物PCR法能有效地从植物和中成药(蜜丸及水丸)中鉴别出柴胡与狭叶柴胡,该方法具有准确、高效、省时、简便的特点。     

基于HPLC指纹图谱的沙棘叶黄酮类功效成分研究

目的:采用高效液相色谱法(HPLC)建立不同产地沙棘叶指纹图谱,对其中异鼠李素、槲皮素和山柰酚含量进行测定,并对不同产地的沙棘叶品质进行综合评价。方法:指纹图谱采用C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液,梯度洗脱,流速为0.8 mL·min^-1,柱温为30℃,进样量为10μL,检测波长为280 nm;采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件进行指纹图谱相似度评价。含量测定采用C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-0.1%甲酸水溶液(58∶42)为流动相,流速为1.0 mL·min^-1,柱温为30℃,进样量为10μL,检测波长为370 nm。结果:建立了不同产地沙棘叶HPLC指纹图谱,相似度为0.647~0.910。通过和对照品比对,对26个共有峰进行峰指认,其中9个共有峰鉴定为英国栎鞣花酸、沙棘宁B、木麻黄鞣宁、表儿茶素、水仙苷、表没食子儿茶素、芦丁、异槲皮苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷;对不同产地沙棘叶中异鼠李素、槲皮素、山柰酚进行HPLC定量分析,结果表明,槲皮素、山柰酚、异鼠李素的质量分数分别为0.12%~0.33%、0.07%~0.32%、0.10%~0.49%。山西忻州沙棘叶槲皮素质量分数最高,为0.33%;内蒙古鄂尔多斯沙棘叶山柰酚质量分数最高,为0.32%;新疆塔城沙棘叶异鼠李素质量分数最高,为0.49%。结论:该方法精密度、稳定性、重复性良好,可有效评价沙棘叶品质。不同产地沙棘叶黄酮类功效成分含量差异较大。     

UPLC测定不同产地、不同部位小叶黑柴胡中黄酮含量

目的:建立一种超高效液相色谱法(UPLC)检测不同产地、不同部位小叶黑柴胡中黄酮含量的方法。方法:Acquity UPLC BEHTMC18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),流动相为甲醇-0.1%H3PO4水梯度洗脱,流速0.4 mL.min-1,柱温30℃,检测波长为256 nm。结果:3个黄酮成分芦丁、槲皮素、异鼠李素分离良好,线性范围分别是0.106~1.06μg,r=0.9998(n=6);0.004 87~0.048 7μg,r=0.999 7(n=6);0.022 0~0.220μg,r=0.999 8(n=6)。结论:该方法测定小叶黑柴胡中黄酮类成分的含量,具有简便准确、可靠的优点。     

不同产地狭叶柴胡中柴胡皂苷含量的测定

目的 测定不同产地狭叶柴胡中柴胡总皂苷及柴胡皂苷a的含量.方法采用可见分光光度法和高效液相色谱法.结果 不同产地狭叶柴胡药材中的柴胡总皂苷和柴胡皂苷a的含量差异较大,且同一药材中柴胡总皂苷与柴胡皂苷a含量的高低不一致,未显示出相关性.结论 为保证狭叶柴胡药材的质量和疗效,应制定药材中柴胡皂苷的限量标准.     

HPLC测定高良姜中槲皮素 山柰素和异鼠李素的含量

目的：建立高良姜中槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量测定方法。方法：采用HPLC法。Kromasil C18色谱柱（5μm,4.6mm×250mm）,流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（52：48）,检测波长：360nm。结果：槲皮素浓度线性范围0.962-24.05μg/mL,r=0.99994;山柰素浓度线性范围1.008-25.2μg/mL,r=0.99990;异鼠李素浓度线性范围0.983-24.575μg/mL,r=0.99996,样品平均回收率为槲皮素97.97%,RSD=1.59%（n=6）;山柰素97.35%,RSD=1.86%（n=6）;异鼠李素98.11%,RSD=2.37%（n=6）。结论：该方法简便、准确、重现性好,可用于该中药的含量测定。     

RP-HPLC同时测定银杏达莫注射液中4种成分的含量

目的:建立银杏达莫注射液中双嘧达莫、槲皮素、山柰素和异鼠李素4种成分的反相高效液相色谱分析方法。方法:以SCIENHOME Kromasil C18柱(250mm×4.6mm,5μm),甲醇-0.4磷酸溶液(55∶45,v/v)为流动相,柱温(32±0.1)℃,于360nm测定银杏达莫注射液中上述4种成分的含量。结果:双嘧达莫、槲皮素、山柰素和异鼠李素分别在21.7~261.0μg/mL,8.0~96.0μg/mL、7.75~93.0μg/mL及5.75~69.0μg/mL内峰面积与浓度呈良好的线性关系。精密度(RSD分别为1.16%,1.35%,1.21%和1.58%)良好。4种成分的平均回收率分别为100.3%,100.0%,99.9%,99.8%。结论:本实验建立了可同时测定双嘧达莫、槲皮素、山萘素和异鼠李素4种成分的RP-HPLC方法。该方法简便、准确,可用于银杏达莫注射液的质量控制。     

银杏达莫注射液中黄酮类和萜类内酯7种成分的定量测定

目的建立银杏达莫注射液定量测定方法。方法黄酮类成分(槲皮素、山柰素和异鼠李素)采用Agela C18柱(150mm×4.6 mm,5μm),乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1.0 m L/min,检测波长360 nm,柱温35℃。内酯类成分(银杏内酯A、B、C及白果内酯)采用Agela C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-四氢呋喃水溶液(10∶75)为流动相,梯度洗脱,体积流量0.8 m L/min,用蒸发光散射检测器检测,柱温30℃。结果分别取10个批次的银杏达莫注射液,测定7个主要成分的量,槲皮素12.4μg/m L、山柰素20.8μg/m L、异鼠李素5.5μg/m L、银杏内酯A 7.2μg/m L、银杏内酯B 2.6μg/m L、银杏内酯C 4.7μg/m L、白果内酯102.0μg/m L。结论建立的方法稳定性、重复性、精密度等方面考察均符合要求,可作为银杏达莫注射液质量控制方法。     

干旱胁迫对柴胡中皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响

为了探究干旱胁迫对柴胡皂苷合成关键酶基因表达和皂苷含量的影响,以期从终产物,基因水平揭示柴胡皂苷合成对环境变化的响应。该研究以定植5个月的柴胡苗为研究材料,通过添加聚乙二醇(PEG)模拟干旱环境,利用HPLC测定不同胁迫程度下,柴胡根中皂苷a和d含量的变化,同时以β-tubulin为内参基因,采用荧光实时定量PCR(RT-q PCR)分析皂苷合成途径中4个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI),法尼基焦磷酸合酶(FPS)和β-香树素合成酶(β-AS)基因的表达。通过研究发现,干旱胁迫处理显著提高了柴胡中皂苷的含量,且当PEG为10%时,柴胡皂苷a和d质量分数最高,分别达到0.648%,0.781%;同时,各基因表达量结果显示,4个关键酶基因的表达均呈现不同程度的上调,其中FPS和β-AS上调极显著(P0.01);此外,相关性分析表明,HMGR,IPPI,FPS,β-AS的表达量和皂苷含量间存在显著正相关关系。因此,干旱胁迫下,柴胡通过调节皂苷合成关键酶基因的表达,来调节次生代谢物皂苷的合成,从而对逆境做出响应。     

南柴胡和北柴胡组成的逍遥散抗抑郁作用的~1H-NMR代谢组学研究

目的 比较不同品种柴胡(南柴胡和北柴胡)组成的逍遥散的抗抑郁功效,探寻其对大鼠内源性代谢产物变化规律的影响.方法 采用慢性温和不可预知应激程序对大鼠进行为期4周的抑郁造模,在造模2周后分别ig给予由南柴胡或北柴胡组成的逍遥散(生药)46 g/kg水提取液、文拉法辛0.05 g/kg干预,每天1次,连续给药2周,观测动物行为学症状.应用核磁共振(1H-NMR)方法分析大鼠血清内源性代谢产物的变化规律.结果 2种逍遥散和文拉法辛对抑郁大鼠行为学指标均有显著影响,与模型组比较差异显著(P＜0.05、0.01).代谢组学研究结果显示,2种逍遥散和文拉法辛干预后,大鼠血清中异亮氨酸、氧化三甲胺、胆碱水平升高,而乳酸、N-乙酰糖蛋白、肌酸、苏氨酸及β-葡萄糖等水平降低,与模型组比较差异显著(P＜0.05、0.01).2个逍遥散组对抑郁大鼠行为学指标的影响组间比较未显示统计学差异.结论 不同品种柴胡组成的逍遥散均具有明显的抗抑郁作用,但功效有所差别,即南柴胡组成逍遥散的抗抑郁效果及起效时间略优于北柴胡.应用行为学与代谢组学相结合的方法评价逍遥散抗抑郁功效具有准确性好、灵敏度高等特点.     

北柴胡及醋北柴胡标准汤剂质量差异性分析

目的 建立北柴胡Bupleurum chinense及醋北柴胡标准汤剂质量评价方法,比较二者质量的差异性。方法 制备北柴胡及醋北柴胡标准汤剂各20批,对醋制前后标准汤剂的pH值及出膏率进行考察;建立北柴胡醋制前后标准汤剂HPLC指纹图谱方法和多指标成分含量测定方法,并结合化学计量学和统计学方法对二者差异进行分析。结果 北柴胡醋制后标准汤剂pH值降低,出膏率降低;建立了北柴胡及其醋制品标准汤剂指纹图谱,分别确定了16个共有峰,指认了其中5个共有峰;北柴胡标准汤剂相似度为0.976～0.995,醋北柴胡标准汤剂相似度为0.946～0.996。主成分分析将北柴胡及其醋制品标准汤剂归为2类,正交偏最小二乘法-判别分析找出二者共7个差异色谱峰,分别为峰1、4(柴胡皂苷c)、6、7(柴胡皂苷a)、9(柴胡皂苷b₂)、10(柴胡皂苷b₁)及13(柴胡皂苷d),为北柴胡及醋北柴胡标准汤剂差异化合物。多指标成分含量测定结果表明北柴胡醋制前后指标成分含量具有显著差异(P<0.05),北柴胡醋制后标准汤剂中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c及柴胡皂苷d含量较低,柴胡皂苷...     

色谱-原子荧光光谱联用技术测定北柴胡中砷的含量

目的:建立色谱-原子荧光光谱联用技术分离测定不同形态砷的方法.方法:色谱-原子荧光光谱联用技术对砷进行测定.色谱及光谱条件如下,阴离子分离柱PRP-X100(4.1mm×250 mm,10μm),流动相15mmoL·L-1(NH4)2HPO4(pH6.0),流速1 mL· min-1,柱温25℃.As空心阴极灯,灯电流/辅阴极灯电流:100/46 mA.结果:砷含量在0.002 ～0.01μg线性关系良好,平均回收率为97.35％(n=6),RSD 1.5％.结论:方法灵敏,准确,重复性好,是分离测试不同形态砷的有效方法.     

北柴胡侧根发育及影响因素探究

目的探索北柴胡Bupleurum chinense侧根发育过程及影响侧根发育的因素,为北柴胡产量提升及商品性改良提供技术支撑。方法对北柴胡品种川北柴1号主根进行石蜡切片观察侧根原基发育动态图,以及添加不同浓度生长调节物质后进行根系参数考察。结果北柴胡侧根原基起源于中柱鞘细胞,部分内皮层细胞也参与侧根原基发育;施加10μmol/L IAA和Ca2+浓度均最大化促进北柴胡根系发育,而浓度过高则抑制侧根发育;施加0.1μmol/L TIBA和10μmol/L EDTA显著促进柴胡根系发育,浓度过高则起抑制效果。结论本研究方法还可以广泛应用于人参、当归等以根入药的药用植物中,对药用植物栽培及育种工作具有重大意义。     

北柴胡达玛烯二醇合成酶基因克隆及表达分析

目的 克隆北柴胡Bupleurem chinense达玛烯二醇合成酶（dammarenediol synthase,DS）基因BcDS，并进行生物信息学及表达模式分析。方法 通过搜索转录组数据库，利用RT-PCR克隆开放阅读框（open reading frame,ORF）和启动子区。通过生物信息在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、结构域、信号肽、三级结构等分子特征，利用Jalview软件进行氨基酸多序列比对，采用MEGA 11.0软件进行分子进化分析。运用实时荧光定量PCR检测基因表达模式。结果 BcDS ORF长2115 bp，编码的蛋白包涵704个氨基酸，相对分子质量为80 770，为酸不稳定的亲水蛋白，无跨膜结构域或信号肽。BcDS与人参、西洋参等植物DS的相似性高，具有达玛烯二醇合成酶特征结构域，且BcDS与人参、西洋参、三七等DS聚为一支。BcDS启动子区域含有响应环境及植物激素的顺式作用元件。BcDS在根中的表达量最高，分别为茎、叶和花中BcDS表达量的5.81、10.44和7.86倍，并受茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和水杨酸（salicyli...     

北柴胡转录因子BcbZIP179的基因克隆及原核表达＊

目的 克隆北柴胡转录因子基因BcbZIP179的全长编码序列，原核表达融合蛋白。为进一步研究该基因在北柴胡转录调控中的功能提供理论依据。方法 以北柴胡转录组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增BcbZIP179基因的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qPCR方法分析BcbZIP179基因在不同组织器官中的表达及MeJA处理条件下的表达情况。构建原核表达载体，在不同温度和IPTG浓度下，采用2种菌株诱导表达目的蛋白。结果 BcbZIP179编码序列全长432 bp，编码144个氨基酸，BcbZIP179受MeJA诱导，在MeJA处理的北柴胡不定根中，处理前24 h内，表达量逐渐升高，随后表达量降低；BcbZIP179在北柴胡的根、茎、叶、花及果实中均有表达，在果实中的表达量最高；利用大肠杆菌原核表达系统，在16℃和37℃不同温度条件下均获得了带有6×His标签的BcbZIP179融合蛋白。结论 克隆到了北柴胡中的1个bZIP家族的转录因子基因BcbZIP179，在16℃、IPTG 0.05 mmol·L^-1条件下，可获得体外表达的蛋白，为制备抗体、分离互作蛋白和调控靶基因进而研究其功能奠定基础。     

基于实时荧光定量PCR分析的北柴胡内参基因的筛选及验证

目的筛选出在北柴胡不同生长时期及不同器官中表达均稳定的内参基因并进行验证。方法利用实时荧光定量PCR获得18个候选内参基因所有Ct值,通过3种不同算法(Bestkeeper、Norm Finder、Ge Norm)的软件对内参基因稳定性进行分析,采用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)分析3个软件给出的稳定性排名结果。结果所有候选内参基因的Ct值相对宽泛,ADF1b、ADF5、ADF7、e IF2b和ACT2为最为合适的内参基因,而e IF6被认为稳定性最差的内参基因。3个软件计算结果均呈现显著性相关。结论采用实时荧光定量PCR结合3种不同算法进行北柴胡内参基因的筛选及验证是可行的。在北柴胡柴胡分子遗传研究中,发掘到的内参基因对目的基因进行均一化处理有助于提高目的基因表达分析的精确性及可信度。     

北柴胡特异DNA条形码筛选及种质资源鉴定

目的 基于北柴胡Bupleurum chinense叶绿体基因组筛选特异性DNA条形码,并利用特异DNA条形码鉴定不同产地北柴胡种质资源。方法 利用Illumina HiSeq X Ten平台对北柴胡进行叶绿体基因组测序,利用mVISTA软件和核酸多样性分析筛选特异性片段,基于特异性片段进一步分析不同产区北柴胡样品单倍型。结果 不同产地3份北柴胡叶绿体基因组全长为155 557～155 959 bp,均呈现典型的环状四分体结构,均编码131个基因。trnV-UAC、trnC-GCA_petN、petN_psbM、ndhF_rpl32可以作为潜在的北柴胡种质资源鉴定的特异性DNA条形码。基于扩增效率,选择petN_psbM和ndhF_rpl32对来自4省7个产地177份北柴胡样品进行序列分析,结果表明petN_psbM和ndhF_rpl32分别有91和78个变异位点,分别鉴定到28、29个单倍型;两段序列联合分析形成40个单倍型（Hap1～Hap40）,各单倍型的遗传距离为0～0.022。6个产地拥有特有单倍型,可以将不同产地的北柴胡种质资源进行区分。结论 利用比较叶绿体基因组学筛选的特异DNA条形码petN_psbM和ndhF_rpl32可以用于北柴胡种内种质资源鉴定,为后续鉴定北柴胡的产地来源、种质资源保护利用和育种等工作奠定基础。