丹参基因组SSR的开发及其多态性分析

目的通过开发丹参基因组SSR标记并验证其有效性,为丹参的分子标记的开发应用提供依据。方法利用Illumina-HiSeq 2000高通量测序技术对山农丹参1号(SNDS1)进行简化基因组测序,对得到的序列利用生物信息学手段进行拼接后查找开发SSR;利用PCR技术检测引物扩增效率。结果共获得2.40Gb的丹参基因组序列,设计开发重复单元长度为2～6碱基的SSR 6000多个;其中2碱基重复和3碱基重复的微卫星单元较丰富;合成600对SSR引物,在丹参上的有效扩增率达85%,经双亲和杂交子代验证其中53%以上的标记具有多态性。结论开发的基因组SSR具有较高的多态性,这在一定程度上大大丰富了在丹参上可以利用的基因组SSR标记。     

川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究

目的 寻找川芎的高效分子标记.方法 以四川崇州、都江堰、新都3个产地的川芎为材料,应用100 条简单序列重复间区多态性(ISSR)引物、64对扩增片段长度多态性(AFLP)引物对30个川芎个体进行多态性筛选.结果 筛选到简单序列重复间区多态性特异性引物共10 条,扩增片段长度多态性特异性引物共6对;分别扩增出106和256条条带,多态条带百分率分别为22.64%和 22.27%.平均标记指数AFLP 的检测效率(1.78)明显高于ISSR(0.42).两种标记基于遗传相似值聚类分析结果存在着一定的差异,但用Mantel测试对两种方法检测的遗传一致度进行相关性分析表明,它们之间存在着显著的相关性( r=0.6975,p=0.014).结论 川芎具有较低的遗传多样性,AFLP更有效于ISSR.     

款冬转录组SSR标记开发及其多态性研究

目的分析款冬转录组数据的简单重复序列标记(SSR)位点信息并设计特异引物,以期为款冬分子标记辅助育种提供有力工具。方法对款冬转录组测序数据库中长度1 kb以上的18 938条unigene,利用MISA软件搜索SSR位点信息,利用Primer3设计引物,并随机选择55对SSR引物分析18份不同来源款冬材料的多态性。结果共搜索到4688个SSR位点,分布于3844条unigene中,SSR出现频率为24.75%,平均7979bp含1个SSR位点。SSR位点中三核苷酸重复类型出现频率最高(37.12%),其次是单核苷酸重复(32.36%)和二核苷酸重复(28.20%)。共有60种重复基元,其中A/T(31.42%)、AG/CT(12.80%)、ATC/ATG(9.62%)是优势重复基元。随机选择55对引物进行多态性验证分析,其中42对有扩增产物,14对具稳定可重复的多态性;利用UPGMA作图,将18份样品分为3类。结论款冬转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,多态性高,为其遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究提供了候选分子标记。     

基于叶绿体基因序列黄精和多花黄精遗传多样性分析

目的基于叶绿体基因联合序列分析不同地理居群黄精和多花黄精遗传多样性。方法目的序列经PCR扩增、测序、拼接和比对后,DnaSP分析单倍型多态性,Permut计算遗传分化,Arlequin分析居群标准分子变异,最后构建基于遗传距离的系统发育树。结果 94条黄精序列存在2个多态性位点,得到3个单倍型,居群间总遗传多样性为0.142,居群内平均遗传多样性为0.018。26条多花黄精序列存在16个变异位点,得到6个单倍型,居群间总遗传多样性为0.857,居群内平均遗传多样性为0.435。结论多花黄精比黄精表现出更高的遗传多样性。两个种群均有较高的遗传分化系数,种群变异主要来源于居群间,整个分布区不存在明显的分子谱系地理学结构。     

党参转录组中SSR位点信息分析

目的采用生物信息学方法分析党参转录组文库EST序列简单重复序列(SSR)位点,快速、大规模鉴定党参功能性SSR。方法使用MicroSAtellite(MISA)软件分析党参高通量转录组SSR的分布频率和重复基元的类型特征,利用软件Primer3设计引物,并通过SSRFinder校验SSR,筛选SSR引物。结果从45 511条Unigenes中共搜到7 327个SSR位点,分布在6 017条Unigenes序列中,发生频率为12.22%,共有415种重复基元,平均每4 520 bp含1个SSR位点,二核苷酸重复占主要地位,发生频率为58.67%,在所有重复基元中,AG/CT出现频率最高。共获得4 329条SSR引物。结论大规模的SSR分子标记开发将有助于党参遗传多样性与分子育种研究。     

磁珠富集法分离半夏微卫星序列

目的:利用磁珠富集法分离半夏微卫星序列,以开发半夏微卫星引物.方法:根据链亲和素磁珠和生物素特异结合的特性,将微卫星探针5'端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合.用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的半夏基因组DNA酶切片段杂交,洗脱未杂交DNA片断后,建立微卫星文库.以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,产物直接克隆,经菌液PCR筛选后测序分析.结果:得到15条半夏微卫星序列,开发效率为93.75%.结论:结果显示这是一种快速而有效的微卫星开发方法.     

金钗石斛转录组SSR位点信息分析

SSR是应用于金钗石斛鉴定和遗传多样性研究的重要分子标记之一。为开发新的SSR标记,寻求快速鉴别金钗石斛的方法,该文通过生物信息学手段对金钗石斛转录组序列进行SSR位点搜索、分析,并设计出SSR特异性引物。结果显示,从金钗石斛转录组中搜索到32 709个SSR,分布与26 742条unigenes中,SSR位点发生频率为12.90%,平均每3 748 bp含1个SSR位点。其中,单核苷酸是最主要重复类型,占SSR总数的72.18%,其次是二核苷酸和三核苷酸,分别占SSR总数的15.97%,11.19%。而在所有重复基元中,A/T出现频率最高,AG/CT次之。通过设计、筛选,该研究共获得62 157对SSR位点特异性引物。从中随机挑选20对引物进行PCR扩增,17对扩增出清晰、可重复的条带,扩增率为85.0%。选择3种石斛检测引物多态性,共获得多态性引物13条。以上结果表明,金钗石斛转录组测序产生的unigenes信息可作为开发SSR标记的有效来源,其中的SSR位点出现密度大、类型丰富、多态性潜能高,在金钗石斛及其近缘种的分子鉴定、遗传多样性与分子育种等方面具有较好的应用前景。     

夏枯草转录组SSR位点信息分析

目的:分析夏枯草转录组中简单重复序列(SSR)信息,为开发夏枯草新的分子标记奠定基础。方法:使用Micro SAtelite(MISA)软件对转录组序列进行SSR位点搜索并利用Primer3软件设计引物。结果:发现4248条Unigenes序列中含有5450个SSR位点,发生频率为27.50%,平均每5933 bp含1个SSR位点;二核苷酸、三核苷酸和单核苷酸重复是其优势重复类型,分别占总SSR数量的44.59%、28.44%、24.75%;在夏枯草转录组中共发现160种重复基元,其中以AG/CT比例最高,约25%,其次是A/T,约占24.26%;夏枯草转录组SSR以5~11次重复为主,其中75.97%的基序长度集中在12~20 bp;共得到4228对SSR位点特异性引物。结论:夏枯草转录组SSR位点出现频率高、重复类型丰富、密度大、多态性较高,通过对夏枯草转录组资源SSR信息的研究,为进一步开发夏枯草SSR分子标记奠定了基础。     

蒙古黄芪转录组SSR标记开发及遗传多样性研究

为开发蒙古黄芪新的SSR标记及为黄芪分子标记辅助育种提供有力工具,该研究利用MISA软件对蒙古黄芪转录组测序序列长度在1 kb以上的18 040条unigene进行SSR位点信息搜索、分析,利用Primer 3设计SSR特异引物并随机选择110对引物进行验证。结果显示在蒙古黄芪转录组共搜索到5 640个SSR,分布于4 462条unigene,SSR位点出现频率为31.26%,平均每6 514 bp含1个SSR位点。SSR位点中单核苷酸重复是主要类型,占总SSR的36.72%,其次是三核苷酸重复和二核苷酸重复,分别占32.57%,27.73%。在SSR位点所包含的75种重复单元中,A/T(2 026)出现频率最高,AG/CT(1 179),AAG/CTT(477)次之。随机选择合成的110对引物中有97对(88.18%)可以扩增出条带,选择条带清晰稳定的19对引物,利用UPGMA作图,将20个样品分为2类。可见蒙古黄芪转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,大量的SSR为其遗传多样性分析、分子鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究提供了丰富的候选分子标记。     

轮叶党参EST-SSR标记的开发及在党参属中的应用

目的开发EST-SSR标记,分析其在党参属及近缘属种间的通用性。方法利用MISA软件对轮叶党参在NCBI公布的EST序列进行SSR位点查找,Primer 3.0软件设计引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,聚丙烯酰胺凝胶电泳对所筛选的引物进行多态性检测。结果共查找到204个EST-SSR位点,总长5 263 bp,平均长度25.80 bp,出现频率为22.97%,其中单核苷酸、二核苷酸和六核苷酸重复占比最多,分别为36.8%、24.8%和15.3%。单核苷酸、二核苷酸、六核苷酸中的主要重复基元类型是A、TG和CAGCTC/GTGGCA。共设计引物112对,以党参为模板,能够扩增出清晰稳定条带的引物有67对,有效引物比率59.82%,其中27对能扩增出多态性条带,多态引物比率24.11%。随机选取5对引物对党参属及桔梗共12份材料进行PCR扩增,聚类结果将党参属和桔梗属分为2大类。结论研究筛选出的EST-SSR标记能够在党参属及近缘属内进行区分鉴别,研究结果为党参种质鉴别、遗传多样性分析及资源的评价利用等提供了重要技术手段。     

桂郁金EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

目的:分析桂郁金EST中SSR位点分布规律,开发桂郁金EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于桂郁金品种遗传多样性的可行性。方法:从NCBI公共数据库下载姜黄属EST序列(expressed sequence tag,EST)12 678条,利用MISA软件对其进行SSR位点查找,选出符合条件的序列,采用Primer 5.0软件设计EST-SSR引物,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳研究这些EST-SSR引物PCR扩增的特点,进一步验证开发结果的合理性与有效性。结果:下载得到的12 678条EST序列中,共有926条序列包含SSR位点,占整个EST数据库的7.30%,其中SSR位点所占比例最大的是二核苷酸重复序列,三核苷酸和四核苷酸次之,分别为623(50.90%)个,388(31.70%)个和125(10.21%)个。根据筛选得到的微卫星序列共设计了165个EST-SSR引物对,选择其中92分以上的24个合成。PCR检测表明,21个引物对(87.50%)可以扩增出稳定清晰的带型;在6份不同种质桂郁金中检测到13对EST-SSR引物有多态性,占设计引物的54.17%。利用13对验证的EST-SSR引物对20个桂郁金品种进行了亲缘关系分析。结论:桂郁金EST-SSR标记开发的效率较高,是桂郁金SSR标记开发的重要措施,对于桂郁金品种鉴定和遗传多样性分析以及育种等方面具有重要的意义。     

三叶青种质资源遗传多样性的ISSR分析

目的对我国三叶青种质资源64个样本的遗传多样性进行分析。方法利用ISSR-PCR技术进行扩增,然后利用POPGENE 32软件及NTSYS软件分析三叶青种质资源64个样本的遗传多样性及亲缘关系,并根据UPGMA法,构建亲缘关系树状图。结果从30条引物中筛选出10条条带清晰、重复性好的引物对64份供试材料的基因组DNA进行扩增。扩增出了83个多态位点,多态百分数为71.43%～100.00%,平均多态百分数为94.31%,引物S17扩增得到的多态位点最多,为11个;引物P6扩增得到的多态位点最少,为5个,10条引物扩增得到的多态位点平均为8.3个;遗传多样性分析显示,平均检测等位基因数(N_a)为1.943 1,平均有效等位基因数(N_e)为1.381 08,64个样本的平均Nei’s基因多样性指数(H)为0.242 98,平均Shannon多样性指数(I)为0.385 83。64个样本遗传相似系数的变异范围为0.431 8～0.988 6。根据相似系数矩阵按UPGMA法进行聚类,在遗传相似性系数为0.715 5处,64份供试材料可分为6组;另外,根据10个ISSR引物的扩增结果,筛选出引物ISSR 20、UBC857和S17扩增的DNA指纹图谱可用于64个三叶青样本种质的鉴定。结论我国三叶青种质资源拥有丰富的遗传多样性和基因的相对稳定性,ISSR分析可揭示我国三叶青种质资源间的亲缘关系,为评价、鉴定和新品种选育提供一定的参考依据。     

南方红豆杉转录组SSR位点分析及其分子标记开发

目的 基于赤霉素（gibberellin A₃,GA₃）处理下的南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei转录组数据鉴定和分析SSR位点,开发可用于南方红豆杉种质资源鉴定和遗传多样性分析的SSR标记。方法 使用MISA软件对南方红豆杉转录组数据进行SSR分析,搜索SSR位点。可搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸,最小重复数分别设置为10、6、5、5、5、5次。采用Primer 3（2.3.5版,默认参数）进行SSR引物设计。通过毛细管荧光电泳检测,最终选定多态性好,扩增成功率高的SSR引物用于后续数据分析;通过MEGA进行UPGMA聚类分析,构建聚类树。结果 转录组测序共获得202 361条Unigene,采用MISA软件搜索出12 008个SSR位点,分布在10 894条Unigenes上,发生频率为5.38%,平均距离为1/7.64 kb。单核苷酸重复类型最丰富,占总SSR位点的51.74%,其次为三核苷酸（20.92%）和二核苷酸重复类型（20.88%）。A/T、AG/CT是优势重复基序,分别占总SSR重复类型的49.60%和10.93%。随机抽选96对SSR引物,以4个地区12份南方红豆杉种质进行引物有效性和多态性验证,筛选出13对具多态性的SSR引物,多态性引物比率为13.54%。13对引物在东北红豆杉Taxus cuspidata扩增效率高达100%,但在曼地亚红豆杉Taxus × media扩增效率仅为23.08%。聚类分析表明太行山地区南方红豆杉聚为一类,浙江、福建和湖南等南方来源的南方红豆杉聚为一类,后三者彼此之间遗传距离更近。结论 南方红豆杉转录组测序产生的Unigene信息可以用来开发SSR分子标记,开发的13个标记将有助于南方红豆杉物种遗传多样性、分子育种、资源保护等方面的研究。     

对叶百部遗传多样性的ISSR分析

目的分析不同居群对叶百部Stemona tuberosa的亲缘关系和遗传多样性。方法应用ISSR分子标记技术研究长江流域以南各省对叶百部的遗传多样性;采用POPGENE32进行亲缘关系分析,NTSYSpc-2.10E进行UPGMA聚类分析。结果 7条ISSR引物共检测到74个清晰的扩增位点,多态性位点74个,多态性位点百分率100%;有效等位基因数(Ne)为1.524 4,平均Nei’s基因多样性指数(He)为0.314 6,平均Shannon多样性指数(I)为0.478 6,各居群间的遗传距离介于0~0.950 2,平均值为0.416 3。结论从分子角度揭示了对叶百部具有较高的遗传多样性,其居群间亲缘关系与地理环境有一定的相关性,实验结果将为后续对叶百部引种栽培及根用药植物资源的持续利用,特异生物碱的筛选及其运用于化学分类,以及对叶百部道地药材产区的科学选择奠定理论基础。     

福建金线莲DALP遗传多样性分析

目的 通过分子标记技术对不同产地野生福建金线莲及近似种的遗传多样性进行分析,了解不同产福建地金线莲及近似种的遗传差异。方法 采用直接扩增片段长度多态性(DALP)分子标记技术,对产多个产地的野生福建金线莲及近似种的18个居群进行多样性检测。结果 筛选出6个引物组合,总共扩增得到355个多态性位点,遗传多态性为100%,平均每组引物扩增所得多态位点为59.2个。其中14个福建金线莲居群多态百分率为95.77%,其平均观测等位基因数(Na)为1.273 4,有效等位基因数(Ne)为1.074 4,Nei’s基因多样性指数(H)为0.056 2,Shannon信息指数(I)为0.096 9,遗传分化系数(Gst)为0.423 0,基因流(Nm)为0.681 9。结论 不同福建金线莲居群之间存在较高的遗传分化、基因交流较小。地理隔离和资源锐减可能是造成福建金线莲居群间基因流动受到限制的原因。     

不同产区黄芩SSR分子标记鉴别研究

目的 采用简单重复序列（SSR）分子标记技术鉴定不同产区黄芩种质资源。方法 基于黄芩基因组数据设计SSR引物,并对来自河北、东北（辽宁、吉林地区）、内蒙古、山东、山陕（山西和陕西）地区共计5个产区的黄芩进行遗传多样性分析及聚类分析。结果 引物组合Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26可以对产地为辽宁、吉林的黄芩进行鉴定区分;引物组合Sb21、Sb22、Sb28可以对产地为内蒙古的黄芩进行鉴定区分;引物组合Sb5、Sb13、Sb16、Sb22可以对产地为陕西、山西的黄芩进行鉴定区分。结论 研究结果可为不同产区黄芩种质资源的鉴定提供一种准确、高效的技术方法。     

基于SSR-HRM技术的4种药用天麻变型遗传多样性及遗传结构分析

目的 比较乌天麻Gastrodia elata f. glauca、绿天麻G. elata f. viridis、红天麻G. elata f. elata和黄天麻G. elata f. flavida4种药用天麻变型的遗传多样性、遗传结构和遗传信息差异，为天麻新品种选育提供依据。方法 从不同产地收集了40份不同天麻变型的花茎。应用简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记与高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)相结合技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，从80对引物中筛选出15对多态性高的SSR引物。对这些天麻花茎样品进行实时荧光定量PCR扩增，统计遗传多样性参数，分析群体遗传结构，结合40份天麻的HRM数据进行聚类分析。结果 从15对SSR引物检测到114个等位基因，平均每对引物7.6个。天麻样品的观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)、和Nei’s多样性指数(Nei’s diversity index,Nei)的平均值分别为0...     

基于SCoT分子标记的金花茶组植物种质资源遗传多样性分析

目的利用SCoT分子标记技术分析27份金花茶组植物种质资源的遗传多样性和亲缘关系,为金花茶组植物种质资源鉴定保护和开发利用提供理论依据。方法从100条SCoT引物中筛选出条带重复性好、多态性高的引物对供试材料进行PCR扩增,用NTsys 2.10e计算种质间的遗传相似系数,用非加权平均距离法(UPGMA)进行聚类分析,构建系统发育进化树。结果从100条SCoT引物中筛选出13条引物共扩增出566条条带,其中多态性条带549条,多态性比率为97%,平均每条SCoT引物扩增的总条带数和多态性条带数分别为43.54、42.23条,多态性比率为89.74%～100.00%,平均为96.82%;27份金花茶组植物种质间的遗传相似系数为0.367～0.754。聚类分析结果显示,遗传相似系数在0.480处可将27份金花茶种质划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5组,遗传相似系数在0.511处第Ⅰ组被划分为a、b亚组,在0.517处第Ⅱ组被划分为c、d亚组,在0.508处第Ⅳ组被划分为e、f亚组。结论不同金花茶组植物种质间的遗传多样性丰富,SCoT分子标记多态性高,重复性好,可有效用于金花茶组植物种质资源遗传多样性分析,为金花茶组植物种质资源的鉴定保护、分子辅助育种和开发利用提供理论依据。     

广西地不容SSR标记开发及遗传多样性研究

目的基于广西地不容转录组序列开发SSR引物,并用于该物种自然居群遗传多样性的研究。方法从广西地不容转录组测序获得的unigene序列中挖掘SSR位点,采用Oligo 7.0软件设计引物,通过电泳法筛选得到多态性高的SSR引物用于遗传多样性研究。结果从广西地不容转录组20 637条unigene序列中,搜索到6 833个SSR位点,出现频率为33.11%。基于转录组序列设计50对引物,筛选得到10对多态性高的引物。10对引物在5个居群63个样本中共扩增得到83个条带,有效条带百分率为100%,多态性信息量(PIC)为0.6889。在物种水平和居群水平上,Nei基因多样性指数(H)分别为0.725 2和0.613 4,Shannon多样性指数(I)分别为1.576 6和1.220 3,观察杂合度(Ho)分别为0.584 5和0.558 4,期望杂合度(He)分别为0.731 2和0.643 5。居群的遗传分化系数(Fst)为0.146 5,基因流(Nm)为1.456 9。UPGMA聚类分析表明,5个居群可分为3支系。结论开发的SSR标记适用于广西地不容的遗传多样性分析。广西地不容在物种和居群水平上均具较高的遗传多样性,遗传分化主要存在于居群内部。     

云贵地区金铁锁EST-SSR遗传多样性分析

目的分析云贵地区金铁锁Psammosilene tunicoides遗传多样性和变异情况。方法采用转录组测序技术开发金铁锁的EST-SSR引物,并利用筛选出的分子标记对金铁锁进行多态性分析。结果共获得了17 530条含SSR位点的EST序列;筛选出了14对具有较高多态性的EST-SSR引物,对云贵地区的17份金铁锁进行多样性分析,发现其在位点水平上多态性信息含量(PIC)范围为0.350 0~0.795 0,具有较高的多态性;在群体水平上明显偏低,多态位点百分率(PPB)为64.29%~100%,Nei’s基因多样性指数的范围为0.188 2~0.477 7,平均0.323 2;云贵地区金铁锁群体内基因流(Nm)较小(Nm均值为0.302 0),群体间存在较大的遗传分化(Fst均值为0.452 9)。结论转录组测序丰富了金铁锁EST数据库;云贵地区金铁锁的遗传多样性可能与其繁殖方式、分布区较长的进化历史有关,群体间遗传分化大可能是地理阻隔截断了不同群体间的基因交流。