PHC1基因敲降对小鼠胚胎干细胞多能干性的影响

探讨多梳家族蛋白PHC1敲降后对小鼠胚胎干细胞(m ESCs)多能干性的影响,并探索其与多能干性基因nanog的转录调控机制。对m ESCs细胞系进行PHC1蛋白沉默处理并设置阴性对照组(control组)和空白对照组(Empty vector组),采用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测PHC1的表达量;荧光素酶报告基因技术(Luciferase Reporter)检测PHC1与nanog reporter之间的转录活性。结果提示:实验组m ESCs呈现分化状态,多能干性基因nanog、oct4、sox2的表达下调,且nanog下调最显著;荧光素酶报告基因结果提示PHC1和nanog可能会形成复合物参与nanog的转录调控(P<0.05)。实验表明,敲降PHC1基因后可能通过影响nanog转录调控,从而参与核心转录调控铁三角(nanog、oct4、sox2)之间的相互转录调控机制,导致m ESCs出现分化,进而参与m ESCs多能干性的维持。     

敲除PKD1基因的小鼠胚胎干细胞的建立

目的：通过PKD1基因打靶载体的胚胎干细胞转染，药物筛选以及分子鉴定，获得发生同源重组的胚胎干细胞克隆，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法：体外培养小鼠胚胎干细胞，用电穿孔的方法进行PKD1基因打靶载体的转移，并用G418进行筛选培养，得到阳性克隆后，进一步扩大培养，抽提胚胎干细胞的基因组DNA，采用DNA印迹法进行分子鉴定。结果：经G418筛培养得到192个阳性在隆，分子鉴定获得2个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论：鉴定得到的2个同源重组胚胎干细胞克隆，为进一步建立PKD1基因缺陷小鼠奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

小鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的:培养、分离和鉴定C57BL/ 6小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell ,ESC).方法:收集小鼠3.5 d 的囊胚进行培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ESC样集落,经两次亚克隆法分离培养成ESC;进行相差显微镜观察,采用阶段特异性胚胎抗原-1 (stage-spesific embryonic antigen,SSEA-1)对培养的ESC进行免疫组化染色. 结果:获得了稳定的ESC集落,传至第12代.ESC呈集落样生长,SSEA-1免疫组化染色强阳性.结论:两次亚克隆法获得的细胞具有ESC主要的生物学特性.     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系

目的利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果。方法利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止。同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响。结论成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具。     

生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞分化的影响

 目的  研究生物钟基因Clock对小鼠诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)非定向分化的作用。方法  将Teto-FUW-OSKM、M2rtTA、PsPAX2 和PMD2.G 4种质粒共转染293FT细胞,收集病毒上清,转染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)获得小鼠iPSC,并通过检测多能性基因表达及其体外分化能力对小鼠iPSC进行鉴定;通过RT PCR检测小鼠iPSC在非定向分化和拟胚体形成过程中生物钟基因的表达,以及生物钟基因Clock下调后,与野生型细胞相比小鼠iPSC多能性基因的表达和形态学改变。结果  通过慢病毒感染MEF的方式获得了小鼠iPSC;小鼠iPSC在非定向分化过程中,生物钟基因Clock、Per2、Rev-erbα表达升高;生物钟基因Clock下调后,小鼠iPSC分化能力下降,多能性基因Sox2、Oct4、Klf4表达升高。结论  生物钟基因Clock对小鼠iPSC的非定向分化起到重要作用。     

Cdyl基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系的建立及鉴定

【目的】 建立Cdyl 基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系(iPSC)。【方法】 通过组织块贴壁法培养Cdyl-/-的胚胎成纤维细胞(MEF)。将pMx-Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和hrGFP五种质粒分别转染Plat-E细胞,收集病毒上清,感染Cdyl-/- MEF获得Cdyl-/- iPSC,并对Cdyl-/- iPS细胞的分子标记及体内外分化能力进行检测。【结果】 取Cdyl-/-胎鼠皮肤,培养得到增殖旺盛的Cdyl-/- MEF。成功包装逆转录病毒并感染Cdyl-/-MEF,得到胚胎干细胞样的Cdyl-/- iPS细胞。该细胞表达AKP、Oct3/4、SSEA-1,在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。【结论】 Cdyl-/- iPS细胞具有自我更新和多向分化能力的特性。Cdyl-/- iPS细胞系的建立为研究Cdyl在小鼠早期胚胎发育中的功能提供一个良好的细胞模型。     

葛根素对小鼠胚胎干细胞源心肌细胞超微结构的影响

目的:探讨葛根素对小鼠胚胎干细胞源心肌细胞肌节及线粒体结构发育的影响。方法:采用悬滴-悬浮-贴壁三步法诱导转基因D3系小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化,在分化过程中持续使用葛根素(100μmol/L)处理;在分化的中期(第16天)和晚期(第20天)将拟胚体的跳动区域切下后制成超薄切片,应用电镜观察其超微结构,并测量肌节的长度。结果:⑴在分化第16天和第20天,葛根素组心肌细胞肌原纤维发育较对照组成熟;⑵分化第16天,葛根素组心肌细胞肌节长度为(1.67±0.02)μm,(n=9),明显长于对照组(1.44±0.15)μm,(n=4,P<0.05)。分化第20天,葛根素组心肌细胞肌节长度(1.88±0.04)μm,(n=6),高于对照组(1.78±0.04)μm,(n=5);⑶与对照组相比,葛根素组心肌细胞线粒体体积较大,嵴较密集。结论:葛根素能促进小鼠胚胎干细胞源心肌细胞肌节结构成熟和线粒体的发育。     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。     

低速离心法分离小鼠胚胎干细胞

目的:探讨获得胚胎干细胞(ES)简单有效的方法.方法:通过普通离心机以600 r/min离心6 min摔裂小鼠完整囊胚,剥离出未分化的内细胞团,培养鉴定ES.结果:低速离心可将内细胞团从完整囊胚中剥离出来,接种在丝裂霉素处理过的饲养细胞上培养时,能在2～3 d获得巢状增殖的干细胞集落,且能反复传代、冻存复苏,并保持胚胎干细胞多个标志物的特征.结论:利用低速离心摔裂完整囊胚法可获得胚胎干细胞系,且操作方便、经济可行.     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子(LIF)的关系.方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养.扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志(CD9、 SSEA1和Flk-1)的表达情况.分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、 Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达.将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力.Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率.结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1.残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志.残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤.单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力.结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力.     

小鼠胚胎干细胞克隆形成和传代的影响因素

目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞(ESC)分离后克隆形成和细胞传代的几种影响因素,对其特性作初步鉴定.方法:对比超排卵和自然受孕2种囊胚获取方法、囊胚培养液和高糖DMEM培养液2种培养液对其克隆形成和细胞传代的影响.对贴壁后形成的原代ESC克隆进行评分.稳定传代的一株ESC进行鉴定.结果:超排卵组、自然受孕组的内细胞团形成率(64.9% vs 68.2%)和原代ECS克隆形成率(10.1% vs 14.5%)比较,差异均无统计学意义(χ2=0.345和1.385,P=0.557和0.239).囊胚培养液组24 h囊胚孵出率明显高于DMEM培养液组(56.8% vs 17.1%)(χ2=33.026,P=0.001),原代ESC克隆形成率明显低于DMEM培养液组(35.2% vs 15.9%)(χ2=9.021,P=0.002).ICM的评分与ESC克隆传代能力相关(r=0.531,P＜0.001),直径70～100 μm、周边规则、隆起明显的ICM,ESC克隆传代持久.结论:高糖DMEM培养液对克隆的分离和传代有利.对ICM贴壁后形成的ESC克隆进行评分有助于确定挑选克隆传代的时机.     

lncRNA-135调控miR-592维持小鼠胚胎干细胞多能性

目的筛选并确定调控miR-592作用的关键lncRNA,探讨其对miR-592沉默靶基因cep135的调控作用。方法利用lncRNA基因芯片筛选小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)及KO miR-592 mESCs中差异的lncRNA从而找出关键调控分子lncRNA-135。利用转染试剂干扰lncRNA-135的表达,使用Western印迹法、双荧光素酶报告系统及免疫细胞化学染色等技术检测lncRNA-135对miR-592及其靶基因cep135的表达影响,进而阐明lncRNA-135对mESCs多能性的调控作用。结果lncRNA基因芯片分离确定了527条差异表达的lncRNA,经过生物信息学分析及qRT-PCR验证,确定了评分最高的lncRNA-135为关键作用分子。双荧光素酶报告系统证实了lncRNA-135能够结合miR-592以干扰其沉默靶基因cep135。而Western印迹法和免疫细胞化学染色结果则证实lncRNA-135通过作用于miR-592,阻止其对cep135的抑制作用,进而促进mESCs的多能性。结论lncRNA-135可以通过充当miR-592的“分子海绵”从而调节与mESCs多能性维持有关的多个基因的表达,这将可能帮助建立调控性miRNA网络与mESCs多能性之间的联系。     

潜在的胚胎干细胞自我更新与多能性的调控基因的鉴定:基于随机森林算法

目的 基于机器学习的方法整合多组学数据在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中鉴定潜在的与干细胞自我更新及多能性相关的基因。方法 收集了mESCs的多组学数据,包括转录组、组蛋白修饰、染色质可及性、转录因子及结构蛋白在染色质上的结合等信息,比较了已知的干细胞自我更新及多能性基因与其他基因的信号差异。整合这些多组学数据,基于包含随机森林在内的多种机器学习分类器构建预测模型并进行了5折的交叉验证。输入的样本中2/3作为训练集用于训练模型,剩余的1/3作为测试集用于独立测试来衡量模型的表现。最终通过基因功能注释和细胞活力测定、克隆形成测定及细胞周期分析等细胞功能实验对模型预测的结果进行了验证。结果 已知的多能性与自我更新基因在多组学数据中有显著区别于随机基因的特征。使用这些数据的算法中随机森林构建的模型具有最好的表现,交叉验证的曲线下面积（AUC）为0.883±0.018,独立测试的AUC为 0.880±0.028。该模型鉴定出了893个潜在的自我更新与多能性相关基因,这些基因在基因功能注释上与已知基因类似,而敲低其中新发现的基因Cct6a会导致mESCs的细胞活性显著降低（P<0.0001）,形成细胞克隆的数目显著减少（P<0.01）,处于G1期的细胞数量显著增加（P<0.01）而处于S期的细胞数量显著减少（P<0.05）。另外,敲低Cct6a基因的mESCs无法被碱性磷酸酶染色。结论 基于多组学数据构建的机器学习模型可以预测潜在的自我更新与多能性相关调控因子且具有较好的效果。通过构建的模型发现了潜在的自我更新与多能性调控基因如Cct6a并进行了实验验证。     

Development of neural precursor cells from mouse embryonic stem cells

Embryonicstemcells(EScells)arederivedfromtotipotentcellsofearlyembryoandpossessunlimited,undifferentiatedproliferationinvitro[1].EScellshavetheinherentcapacityofdifferentiatingintoallcelltypesofthenervoussystemasdemonstratedbytheex-perimentthatchimericmicewereformedfromem-bryosinwhichEScellsaretransplantedintotheinnercellmass[2].ThesuccessfulestablishmentofhumanEScelllineindicatedprofoundimplicationthatEScellsmayprovideavirtuallyunlimiteddonorsourcefortransplantation[3]. Threepaperspublish…     

抗坏血酸诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞

目的探讨采用抗坏血酸诱导体外培养小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell,mESC）分化为心肌细胞的可行性。方法未分化ES细胞在滋养层上长至汇合,胰酶消化成单个细胞经旋转生物反应器（RCCS）制备拟胚体（em-bryoid bodies,EBs）,EBs贴壁后用抗坏血酸诱导分化为心肌细胞。通过光镜观察跳动的心肌细胞,采用免疫组织化学、激光共聚焦显微镜（CLSM）和RT—PCR的方法鉴定心肌细胞。结果抗坏血酸能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化,诱导效率为90％;分化的心肌细胞自发而有节律地收缩,心肌肌钙蛋白T（cTnT）、α-辅肌动蛋白（α—actinin）、肌动蛋白（actin）表达阳性。此外,分化的心肌细胞还表达调控心肌发育的基因α—MHC、β—MHC。结论抗坏血酸能有效地诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞。