灰毡毛忍冬化学成分研究

目的：研究灰毡毛忍冬花蕾的化学成分。方法：灰毡毛忍冬药材90%乙醇提取液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取。石油醚萃取部分反复柱层析得到化合物（1～9）。结果：从灰毡毛忍冬花蕾的石油醚萃取物中分离鉴定了9个化合物：白果醇（1）、正三十烷醇（2）、乌苏酸（3）、β-谷甾醇（4）、正三十烷（5）、棕榈酸（6）、β-胡萝卜苷（7）、3-辛烷基,3-癸烷基二十二烷醇（8）、3-壬烷基,3-十二烷基二十二烷醇（9）。结论：除化合物4外均为首次从本植物中分得,其中化合物2、3、5、8和9为首次从忍冬属中分得。     

灰毡毛忍冬的染色体及核型分析

目的对药用植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand．-Mazz的染色体数目和核型进行研究。方法采用常规制片方法，经显微摄影后对染色体进行分析。结果灰毡毛忍冬的体细胞染色体数目为2n=18，核型公式为K（2n）=2x=18=2m＋8sm（2SAT）＋8st（4SAT），染色体相对长度组成为2n=18=4L＋4M2＋4M1＋6S，染色体总长为47．264μm，长臂总长为34．8261μm，核型不对称系数（AS．K％）为73．71％，属于“3B”型。结论灰毡毛忍冬染色体的数目、核型等清晰准确。     

灰毡毛忍冬LmC3H1基因的克隆及表达模式与绿原酸含量相关性分析

目的:以灰毡毛忍冬为材料,克隆对-香豆酸3-羟化酶(LmC3H1)基因,进行生物信息学和表达模式分析,结合绿原酸含量,研究推测灰毡毛忍冬LmC3H1基因的功能。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆LmC3H1基因的全长c DNA序列,对该序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和HPLC分别测定灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花中LmC3H1的相对表达量及绿原酸含量。结果:克隆得LmC3H1(Gen Bank:MN177695)基因,开放阅读框(ORF)长度为1 533 bp,编码510个氨基酸,推测其分子式为C_(2618)H_(4134)N_(718)O_(727)S_(22),相对分子质量为58 005.32,等电点8.92,为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,具有跨膜区域LLLIPAVLFLISLVYPLI,含有细胞色素P450的保守结构域CYTOCHROME_P450(422-433 aa);Real-time PCR结果显示,LmC3H1在灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花有不同程度的表达,其中在花发育阶段,白色花蕾期相对表达量最高,花蕾初期及白色开花期次之;白色花蕾期花与茎、叶比,花的相对表达量最高,叶的最低;HPLC结果显示,从绿白色花蕾期到金黄色开花期绿原酸含量呈上升趋势,金黄色开花期含量最高,不同器官中,花中绿原酸最高,茎最低。结论:克隆得到灰毡毛忍冬LmC3H1基因,推测LmC3H1可能参与灰毡毛忍冬花绿原酸的生物合成。该研究为进一步研究该基因的功能及探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据,同时为遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定了基础。     

灰毡毛忍冬花蕾中的化学成分

目的：对灰毡毛忍冬花蕾的化学成分进行研究，方法：应用溶剂萃取及枉层析方法进行化学成分分离、纯化，并利用各种光谱技术分析鉴定结构、结果：从灰毡毛忍冬花蕾中分离得到11个化合物，其中3个绿原酸类成分、4个黄酮类成分、4个其他成分，分别为：1—O-咖啡酰基奎宁酸（Ⅰ），4-O-咖啡酰基奎宁酸（Ⅱ），5-O-咖啡酰基奎宁酸丁酯（Ⅲ），槲皮素（Ⅳ），苜蓿素-7-O—β-D-葡萄糖苷（Ⅴ），槲皮素-3-O—β-D-葡萄糖苷（Ⅵ），木犀草素-7-O—β-D-半乳糖苷（Ⅶ），肌醇（Ⅷ），Ⅶ-谷甾醇（Ⅸ），正十九烷醇（Ⅹ），葡萄糖（Ⅺ）．结论：化合物Ⅰ、Ⅱ为首次从忍冬属植物中分离得到，化合物Ⅲ～Ⅺ为首次从该种植物中分离得到．     

灰毡毛忍冬规范化种植研究

按照《中药材生产质量管理规范》（GAP）的要求，结合课题组试验研究成果和当地环境情况，经过近3年试验研究，初步总结出四川古蔺灰毡毛忍冬GAP栽培技术，为规范灰毡毛忍冬生产环节和保证灰毡毛忍冬质量提供初步研究资料。     

灰毡毛忍冬花蕾水溶性化学成分研究

目的:研究灰毡毛忍冬花蕾的水溶性化学成分。方法:采用多种层析分离技术进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。结果:从灰毡毛忍冬干燥花蕾的水提物中分离得到了6个化合物,分别鉴定为:反式-芳樟醇-3,7-氧化物-6-O-β-D-葡萄糖苷(1)、secologanoside(2)、secoxyloganin(3)、绿原酸(4)、咖啡酸(5)、蔗糖(6)。结论:化合物1为首次以单体化合物形式从自然界中分离得到,化合物2、3为从该植物中首次分离得到。     

灰毡毛忍冬CHI和CHS基因的克隆及功能研究北大核心CSCD

该研究基于灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种转录组数据,筛选到黄酮生物合成关键限速酶基因CHI和CHS的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过在线生物信息学分析软件和qRT-PCR分析编码蛋白特性和不同花期、不同部位下CHI、CHS基因的表达模式,HPLC测定木犀草苷含量并结合表达量做相关性分析。结果显示,灰毡毛忍冬2个品种中CHI、CHS基因,分别包含627、1170 bp的ORF区,且CHI蛋白和CHS蛋白均为稳定、带亲水性的非分泌型蛋白。qRT-PCR结果表明2个品种CHI、CHS基因在不同花发育阶段及茎、叶中均有差异表达,且在关键花期表达差异明显,结合HPLC数据,木犀草苷含量与基因相对表达量之间呈现负相关性。推测灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因参与调控黄酮化合物的累积,可进一步进行其功能研究。该研究首次克隆了灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因并进行表达分析,丰富了灰毡毛忍冬黄酮生物合成研究,为进一步探究灰毡毛忍冬中木犀草苷等黄酮类成分差异的分子机制以及良种选育提供研究基础。     

灰毡毛忍冬Lm-XL-AP1基因克隆、生物信息学和时空表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬突变型品种AP1基因(Lm-XL-AP1),并对其进行生物信息学和时空表达分析。方法通过RACE技术克隆Lm-XL-AP1基因全长,运用生物信息学的方法进行基因同源性和相似性比较分析,预测其编码蛋白,并对其进行各种理化性质分析。运用荧光定量PCR(q RT-PCR)检测该基因在灰毡毛忍冬突变型植株不同花期和不同器官的相对表达量。结果获得AP1基因,开放阅读框(ORF)长729 bp,编码242个氨基酸,与甘菊中MADS-box基因家族AP1基因相似性达80%,且包含MADS和K-box的保守序列。AP1蛋白无跨膜区域,定位于细胞核中;在灰毡毛忍冬突变型植株第6花期相对表达量最高,同时茎、叶中也有表达。结论成功从灰毡毛忍冬突变型植株总RNA中克隆到可能参与控制花器官表达的AP1基因。     

不同品种灰毡毛忍冬ACS3基因克隆、表达及生物信息学分析

目的分别克隆灰毡毛忍冬野生型与湘蕾型ACS3基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法筛选灰毡毛忍冬转录组数据库中与ACS蛋白同源性较高的Unigene序列,设计引物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RACE技术对该Unigene进行全长克隆;用生物信息学软件分析蛋白的理化性质、结构域和同源性等特性;借助qRT-PCR检测1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS3)基因在不同品种、不同花期灰毡毛忍冬中表达模式。结果从灰毡毛忍冬野生品种及湘蕾品种中分别克隆得Lm-ACS3(GenBank:MH724196)及Lm-XL-ACS3(GenBank:MH724197),开放阅读框长度均为1452bp,编码483个氨基酸,包含保守的Aminotran_1_2结构域,与其他植物的ACC合酶具较高相似度;qRT-PCR结果显示,野生型ACS3基因不同花期间表达差异显著,从花期3开始呈整体明显上升趋势,湘蕾型中花期间表达差异相对较小。结论分别克隆得到灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型ACS3基因,该基因在2品种中具不同表达模式;推测ACS3基因或为导致灰毡毛忍冬不同品种间差异表型的可能功能基因之一,为进一步验证该基因在调控蕾期长短及花表型的生物学功能提供实验基础。     

灰毡毛忍冬花蕾中三萜皂苷类化学成分研究

目的研究灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides花蕾中的化学成分。方法采用正相硅胶、ODS、Sephadex LH-20、半制备高效液相色谱等方法对灰毡毛忍冬花蕾的水提取物进行分离纯化,采用NMR、MS等波谱方法进行鉴定结构,采用MTT法研究化合物的细胞毒活性。结果从灰毡毛忍冬花蕾中分离得到了7个三萜类化合物,分别鉴定为3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖基常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(1)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(2)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(3)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(4)、3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(5)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖基常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(6)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(7)。结论化合物1为新化合物,命名为灰毡毛忍冬皂苷丙;化合物2～7为首次从该植物中分离得到。细胞毒活性结果显示,化合物1、4和5对人宫颈癌He La细胞均有一定的抑制作用,其IC50值分别为54.3、43.9、61.2μmol/L。     

姜黄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对姜黄Curcuma longa苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(Cur PAL)全长进行克隆并开展生物信息学分析,为姜黄次生代谢产物的生物合成机制研究奠定基础。方法利用RT-PCR和RACE相结合的方法,以姜黄叶片c DNA为模板,克隆获得Cur PAL全长,进行生物信息学分析。结果克隆的Cur PAL(登录号为KJ780359)全长c DNA为1 293 bp,其中包括5’-UTR 243 bp,3’-UTR 123 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码308个氨基酸;预测蛋白质相对分子质量为33 000,理论等电点p I为5.76;Cur PAL蛋白性质稳定,为可溶性蛋白;Cur PAL编码的蛋白质序列包含与夹竹桃PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点,氨基酸序列多重比较发现,Cur PAL编码的氨基酸序列与中国李、浙江红山茶、拟南芥、辣椒、小果野蕉PAL氨基酸序列的同源性达到75%以上;与姜目类的植物(如小果野蕉)的PAL聚为一支,说明两者亲缘关系较近;通过蛋白质二维、三维结构的预测,表明Cur PAL蛋白为全α型蛋白,由同源四聚体构成。结论首次克隆并获得Cur PAL基因全长c DNA,为姜黄素生物合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据。     

灰毡毛忍冬对小鼠免疫调节及肝损伤保护作用研究

 目的 研究灰毡毛忍冬花蕾对小鼠免疫调节和肝损伤保护作用。方法 采用环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型结合腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞体外增殖实验,评价其免疫调节作用;分别用四氯化碳和酒精诱导小鼠肝损伤模型,评价其对肝损伤的保护作用。结果 灰毡毛忍冬1.6、3.2和6.4 g·kg^-1均能显著提高免疫低下小鼠胸腺指数、脾指数、巨噬细胞碳廓清与吞噬指数以及腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞增殖能力（P<0.01）,3.2和6.4 g·kg^-1均能显著降低四氯化碳和酒精诱导肝损伤小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平和肝组织中丙二醛水平（P<0.01）,显著升高肝组织中超氧化物歧化酶水平（P<0.01）,明显减轻肝组织的病理学损害。结论 灰毡毛忍冬能显著提高环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠免疫功能,对四氯化碳和酒精导致的小鼠肝损伤有较好的保护作用。     

白及苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、序列特征及激素响应表达分析

目的苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物次生代谢与抗逆反应的关键酶类之一,研究PAL基因的序列信息与逆境胁迫响应模式,揭示其蛋白结构与功能及抗逆信号网络。方法采用RT-PCR、RACE技术获得白及PAL基因c DNA全长;Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析其编码蛋白的理化特性、结构域等特征;DNAMAN、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对与系统进化分析;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行PAL基因时空表达特异性与外源激素胁迫下响应检测。结果克隆得到的Bs PAL基因c DNA全长为2 708 bp,编码1条797个氨基酸组成的多肽,预测蛋白质相对分子质量为86 216.94,等电点6.24,具有植物PAL酶的典型结构域和活性中心,不具有跨膜结构域,与铁皮石斛、蝴蝶兰的PAL基因亲缘关系最近。q RT-PCR结果表明白及根中PAL表达量显著高于叶与茎。在Me JA处理下,PAL表达量呈逐渐上升再下降的趋势;SA处理下,则是先下降再上升的趋势。结论白及PAL基因的克隆与序列特征分析、表达检测及响应Me JA和SA胁迫后的表达变化为阐明白及苯丙烷代谢途径与激素信号通路研究提供实验基础。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2650bp,含有一个完整的2154bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

灰毡毛忍冬种子萌发与幼苗生长影响因子研究

通过研究灰毡毛忍冬种子萌发与幼苗生长影响因子,旨在提高其种子繁殖效率,并为制定种子质量检验方法提供依据。观察灰毡毛忍冬果实和种子形态特征,测定种子吸水量,同时设不同湿沙层积时间、温度和发芽床处理,测定其发芽势、发芽率、发芽指数对种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明灰毡毛忍冬种子吸水通透性无障碍,22 h后吸水量接近饱和;4℃湿沙层积处理80 d前,随着层积时间增加种子初始发芽时间缩短,发芽率和发芽势提高,层积100 d,发芽率降低;15℃下,种子发芽和幼苗生长各项指标最佳,其中光照条件下的幼苗子叶宽度显著大于黑暗条件下;种子在纸上、砂上的发芽势、发芽率和发芽指数显著高于其他发芽床,且霉变率低。灰毡毛忍冬的标准发芽试验规程为:种子于4℃湿沙层积80 d,纸上或砂上发芽床,15℃恒温光照培养,首次计数为置床后第4天,末次计数为第23天,统计发芽势的时间为置床后第13天。