欧洲花楸悬浮细胞对生物胁迫的记忆功能初探

植物对其所遭受的环境胁迫存在记忆功能,当再次受到重复的环境胁迫时能更快更好地启动对环境胁迫的应答和适应机制,从而实现长期稳定的繁衍生存.但是这类研究大都体现在农作物以及模式植物拟南芥中,在药用植物中少有研究这种记忆功能对植物生长状态的作用以及对植保素生物合成的影响.该研究采用酵母提取物(YE)作为模拟生物胁迫的诱导子,...     

欧洲花楸糖基转移酶基因的全长克隆与表达分析

目的:研究欧洲花楸植保素糖基化修饰的相关基因,从欧洲花楸悬浮细胞中克隆糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:基于欧洲花楸转录组数据设计特异性引物,克隆得到2条Sa UGTs基因的c DNA序列,构建HIS-MBP-pET28a-SaUGTs原核表达载体,诱导表达Sa UGTs重组蛋白。结果:克隆得到2条糖基转移酶基因Sa UGT1和Sa UGT2序列,完整开放阅读框为1 458 bp和1 431 bp,分别编码485和476个氨基酸,相对分子质量为54. 27 k Da和53. 49 k Da,理论等电点为5. 50和5. 63。生物信息学分析显示,无信号肽,含有糖基转移酶家族保守结构域(PSPG)。系统进化结果显示Sa UGT1和Sa UGT2蛋白与拟南芥UGT85家族亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测显示,欧洲花楸悬浮细胞经酵母提取物(YE)诱导后,Sa UGT1和Sa UGT2的相对表达量明显上调,分别在24 h和12 h达到最大值。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达Sa UGT1和Sa UGT2重组蛋白,并得到了纯化的重组蛋白。结论:该研究首次在欧洲花楸中克隆得到糖基转移酶基因,并成功构建了原核表达载体,为进一步研究该类基因的功能奠定了基础。     

人参多向耐药性转运蛋白基因保守区序列的克隆及分析

目的 对人参多向耐药性(PDR)转运蛋白基因进行克隆及序列分析.方法 利用其他植物PDR基因的保守区域设计简并引物,以人参根总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增人参PDR基因片段并连接至pGEM-T Easy载体上,阳性克隆经PCR检测后测序.结果 得到一段长693 bp的基因序列,序列分析表明,该片段编码231个氨基酸,与植物PDR基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别在76％和80％以上.分析表明该序列属于PDR转运蛋白的核苷酸结合域,具有PDR转运蛋白的C端Walker A、ABC标签模体和C端walker B 3个保守功能域.结论 首次从人参中克隆出PDR转运蛋白基因,为研究人参次生代谢产物的转运和积累机制奠定了基础.     

刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析

目的对刺五加Eleutherococcus senticosus GAPDH基因进行克隆及序列分析,使其成为可用的内参照基因。方法采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,运用RT-PCR法克隆GAPDH基因的部分序列,并以其为内参照基因进行半定量PCR。结果克隆了长度为627 bp的刺五加GAPDH基因,推测其编码209个氨基酸,与三七、人参、拟南芥的GAPDH氨基酸序列同源性分别为97%、93%、93%,核苷酸同源性分别为94%、86%、84%。其作为内参照基因的半定量PCR具有良好的扩增效果和重现性。结论首次分离并克隆了刺五加GAPDH cDNA,证实该序列可以作为基因表达分析的内参照基因,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机制研究奠定基础。     

人参AGO1基因的克隆及序列分析

目的: 从人参叶片中克隆Argonaute 1(PgAGO1)的全长基因,并利用生物信息学方法进行分析。 方法: 根据人参EST序列设计特异性引物,采用RACE方法克隆PgAGO1的cDNA全长,并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。 结果: 克隆的PgAGO1全长cDNA为3 776 bp,其中包括5'UTR 204 bp,3'UTR 254 bp,基因内部包含完整的开放阅读框,可编码1 105个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为122.22 kDa,理论等电点pI 9.71;实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量最高,在根中最低。 结论: 从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA,为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白(Actin)基因进行克隆及序列分析.方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序.结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87％以上.结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

鱼腥草查耳酮合成酶1基因cDNA克隆、差异表达及其蛋白质序列分析

目的 克隆鱼腥草查耳酮合成酶1（CHS1）基因并分析其蛋白质序列。方法 根据已经克隆的植物CHS基因的保守序列设计一对引物,以鱼腥草总RNA为模板,采用RT-PCR和SON-PCR的方法快速获得CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 188 bp的序列,序列分析表明,该片段编码395个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在62.3%以上,生物信息学分析表明,该蛋白含有CHS家族的特征多肽序列“RLMMYQQGCFAGGTVLR”和“GVLFGFGPGL”,不含信号肽序列。相对荧光定量PCR分析表明,CHS1基因在花中的表达量最高,其次是地上茎,再次是地下茎,叶片中表达量最低。结论 首次从鱼腥草中克隆了CHS1基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白(actin)基因进行克隆及序列分析.方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78％以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90％以上.结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

铁皮石斛镁离子转运蛋白基因的克隆及表达分析

目的 克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛镁离子转运蛋白(magnesium transporter,MGT)基因(DoMGT1)并进行生物信息学和表达分析.方法 采用RT-PCR和RACE技术,获得基因cDNA全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特征;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时定量PCR(qPCR)检测基因表达模式.结果 克隆到DoMGT1(GenBank注册号KJ995532),cDNA全长1 625 bp,编码一条由425个氨基酸组成的肽链,相对分子质量47 400,等电点4.79;DoMGT1蛋白含有CorA家族镁离子转运蛋白保守结构域(313～420)和镁离子转运蛋白MRS2/LPE10保守域(27～420);DoMGT1与多种植物MGTs基因一致性为46%～63%,编码蛋白与水稻OsMGTD、OsMGTE、OsMGTF等聚在一起,与AtMGT4共同构成植物MGTs基因的一大类群;DoMGT1基因转录本在石斛根、茎、叶器官中为组成型表达,叶中相对表达量较高,为根中的3.46倍;茎次之,为根的1.54倍.结论 成功克隆到一个镁离子转运蛋白基因DoMGT1,其转录本在叶中高的表达特征暗示该基因可能在铁皮石斛叶的生长发育中发挥重要作用.     

茯苓细胞色素P450基因PcCYP的克隆与序列分析

目的 筛选与茯苓Poriacocos生长发育相关的细胞色素P450基因序列,进一步丰富对茯苓生长发育理解。方法通过分子克隆到1个茯苓细胞色素P450基因Pc CYP,并利用在线工具分析其序列,预测蛋白的理化性质、结构域等分子特征;利用MEGA5.0分别对氨基酸进行多序列比对和进化关系分析,并采用q RT-PCR方法检测不同发酵培养时间6、8、10d的相对表达量。结果 从茯苓中克隆到的Pc CYP存在可变性剪切,2个选择性剪切体PcCYP1和Pc CYP2CDS区长度分别为1590、1542bp,分别编码529、513个氨基酸。氨基酸序列分析发现其均具有保守的P450结构域,且具有信号肽和多个磷酸化修饰位点,属于分泌型的不稳定亲水蛋白。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示PcCYP与担子菌Coprinopsis cinerea的CYP502距离最近,推测PcCYP和CYP502具有相似功能,即参与调控茯苓子实体的发育。定量PCR结果显示,选择性剪接变体Pc CYP1的表达量较Pc CYP2低,因此PcCYP2是Pc CYP基因的主要剪接体。结论 Pc CYP与茯苓子实体的生长发育密切相...     

3种重金属对欧洲花楸悬浮细胞生物量的影响

目的： 以欧洲花楸悬浮培养细胞（SASC）为材料,研究非生物诱导子-重金属对SASC生物量的影响。方法： 配制不同浓度的氯化镧、硝酸铜、硝酸铅溶液对SASC进行处理,用电子天平进行SASC生物量测定。结果： 低浓度氯化镧刺激细胞生长而高浓度则抑制细胞生长,对细胞生长的影响表现为Hormesis现象,最适刺激质量浓度为0.01 mg·L^-1;低浓度硝酸铜抑制细胞生长,高浓度刺激细胞生长,0.05 mg·L^-1 硝酸铜处理后细胞生物量最低;基本所有浓度的硝酸铅都表现为刺激细胞生长,最适刺激质量浓度为0.5 mg·L^-1。结论： 重金属诱导子影响了SASC的生物量,且其作用程度和方式与氯化镧、硝酸铜、硝酸铅3种诱导子种类及浓度相关。     

茅苍术DXS基因的克隆与分析

目的:克隆茅苍术萜类化合物生物合成关键酶1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,并进行序列特征分析和组织特异性表达分析。方法:根据转录组测序所得的DXS基因片段,克隆出全长c DNA序列。运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),以tublin为内参基因,检测DXS基因在不同组织中的表达量。结果:克隆得到的DXS基因全长c DNA序列为2 151 bp,编码716个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号KY659208)。氨基酸序列系统发育分析表明,该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性。Real-time PCR法检测发现茅苍术DXS在叶片中表达量最高,其次为花,而在根茎和根中表达很低。结论:获得了茅苍术DXS基因的全长c DNA序列,对其进行了初步生物信息学分析,揭示了其组织差异性表达特征,为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础。     

大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因的克隆及其序列分析

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计特异引物,以嫩叶总RNA逆转录的c DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Am Csl基因全长,并进行TA克隆测序,利用多种软件对该序列进行生物信息学分析。结果:Am Csl全长c DNA为1 438 bp,包含1个561 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码186个氨基酸,蛋白质分子式为C_(1011)H_(1547)N_(233)O_(257)S_(10),理论相对分子质量为22. 40 k Da,理论等电点(PI)为7. 59,脂肪族指数(AI)为116. 88,存在跨膜区,无信号肽,可能定位于内质网膜,平均疏水系数为0. 670,不稳定指数为42. 56,属于疏水性不稳定蛋白,保守结构域包含了1个纤维素合成酶超家族结构域,二级结构以α-螺旋为主。氨基酸多序列比对和系统进化树分析发现,Am Csl与同科植物葡萄有较高的同源性。结论:获得了大叶蛇葡萄Am Csl基因的全长,对其进行了初步的生物信息学分析,为进一步研究大叶蛇葡萄多糖的积累和生物合成的调控奠定了必要基础。     

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

目的:从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase,AACT)基因,进行生物信息学分析和原核表达。方法:提取垂序商陆根的总RNA,然后逆转录合成c DNA,在分析垂序商陆转录组数据的基础上,设计Pa AACT基因的特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增Pa AACT基因的c DNA序列,通过构建原核表达载体p ET-32a-PaAACT,诱导表达并且纯化目的蛋白。结果:Pa AACT基因开放阅读框为1 254 bp,编码417个氨基酸。生物信息学分析显示Pa AACT蛋白的分子式为C1 914H3 120N538O576S17,推测其相对分子质量为43. 43 k Da,理论等电点8. 90,不稳定系数32. 27,属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果,Pa AACT蛋白属于硫解酶家族成员,在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。Pa AACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示Pa AACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21 (DE3)菌株中表达了Pa AACT重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。结论:该研究从垂序商陆中克隆Pa AACT基因,为下一步测定Pa AACT酶催化活性、制备抗体奠定基础,也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。     

酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物的机制探究

以欧洲花楸悬浮培养细胞（SASC）为材料,检测酵母提取物（YE）处理后SASC生理生化指标的变化,初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制。结果表明： YE诱导SASC合成了5种联苯类化合物,且5种化合物含量随诱导时间的延长呈现不同的变化规律;YE处理抑制细胞的生长;细胞培养液中的pH随着处理时间的延长逐渐降低;细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势,YE处理组（YE组）可溶性蛋白质含量与对照组（CK组）相比显著增加,最高时相对增量达到了147.76%;CK组和YE组细胞外Ca²⁺都表现为内流,但YE组的内流明显小于CK组。说明YE诱导使细胞处于一种胁迫状态,不利于细胞的生长,迫使细胞合成了联苯类化合物抵御外界胁迫;细胞内可溶性蛋白可能作为酶类参与调控化合物的合成;Ca²⁺信号分子可能介导细胞应对YE胁迫的信号转导。     

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析。方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的c DNA全长,并通过DNAMAN软件和Ex PASy在线分析等对其进行了生物信息学分析。结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的c DNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上。结论:获得了AsPAL c DNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础。     

黄连NRAMP5基因的克隆与生物信息学分析＊

目的 获得并分析黄连（Coptis chinensis Franch.）中自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural Resistance-Associated Macrophage Protein，NRAMP）的编码基因。方法 根据黄连基因组测序结果中的NRAMP基因序列设计特异性引物，经PCR扩增得到黄连NRAMP5编码序列，进行TA克隆、测序及生物信息学分析。结果 得到黄连NRAMP5 cDNA序列，全长1611bp，编码536个氨基酸，通过与Genbank上的其他蛋白序列比对，将其命名为CcNRAMP5；序列分析表明黄连NRAMP5基因编码的氨基酸序列包含一个典型的NRAMP结构域（PF01566），是一种拥有11个跨膜结构域，亚细胞定位于质膜处的膜蛋白，具有疏水性强的特点。二级结构中肽链构象主要包括α-螺旋与无规则卷曲两部分；三级结构模型具有葡萄球菌锰转运突变体（MntH）的晶体结构。通过系统进化关系分析推测其可能具有二价金属离子转运功能。结论 首次通过克隆得到黄连NRAMP5基因，并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测，这些结果将为黄连NRAMP5基因的功能研究以及其对镉转运的调控机制提供理论依据。     

铁棍山药SUS基因CDS区克隆与生物信息学分析

目的:对铁棍山药蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)基因的编码区域(coding sequence,CDS)进行克隆和蛋白质结构分析,为该基因的调控机制与山药多糖的合成机制提供理论依据。方法:提取铁棍山药总RNA并反转录为cDNA第一链,根据本实验室铁棍山药基因组数据经注释得到的SUS基因序列设计一对特异性引物,利用基因克隆技术获得SUS基因的编码区域并通过蛋白质预测分析软件分析蛋白质序列特征。结果:克隆得到一个长度2 448 bp的基因序列,具有一个完整的开放阅读框架(open reading frame,ORF),命名为DoSUS1。DoSUS1的分子式为C_(4209)H_(6534)N_(1115)O_(1205)S_(23),相对分子质量9 788.32,共815个氨基酸,理论等电点(PI)6.10,消光系数为110 505,脂溶性指数(AI)为94.15,不稳定指数为32.18,平均亲水指数(GRAVY)为-0.225,属于稳定可溶性酸性蛋白质。DoSUS1氨基酸序列存在多个磷酸化位点,不存在跨膜区与信号肽。蛋白质二级结构与三级结构结果显示DoSUS1属于全α类蛋白质。功能域预测结果显示DoSUS1有蔗糖合成与糖基转移两个功能域。同源性比对结果显示DoSUS1的氨基酸序列与所比对单子叶植物的氨基酸序列相似性均80%。系统进化树显示DoSUS1与单子叶植物的SUS进化关系较近。结论:首次从铁棍山药中克隆出SUS基因的编码序列,并对其蛋白质结构进行了分析,为进一步阐明SUS在山药生长发育和多糖合成机制中的作用奠定了基础。     

白花前胡CAL基因的克隆和原核表达分析

目的 克隆得到白花前胡花发育关键基因CAULIFLOWER（CAL）并对其进行原核表达和基因表达分析。方法 根据白花前胡转录组数据中的基因序列信息,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从白花前胡中克隆CAL基因,命名为PpCAL1和PpCAL2。构建原核表达载体pET-32a-PpCAL1和pET-32a-PpCAL2,并转化至大肠埃希菌Transetta（DE3）进行诱导表达。运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析抽薹开花前后白花前胡不同组织的基因相对表达量。结果 PpCAL1和PpCAL2的开放阅读框（ORF）长度分别为645、738 bp,分别编码214、245个氨基酸。结构功能域分析表明,PpCAL1和PpCAL2蛋白都具有MADS_MEF2_like和K-box保守结构域。原核表达结果显示,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷可成功诱导目的蛋白表达。系统进化树分析显示,白花前胡PpCAL1与胡萝卜DcCAL聚为一支,白花前胡PpCAL2与橡胶树HbCAL聚为一支。基因表达结果显示,PpCAL1和PpCAL2在不同组织中均在开花后表达量上调。结论 克隆并分析白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因,为进一步研究白花前胡开花基因提供参考。