基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究

目的:筛选获得金银花真伪鉴别SNP位点并建立双向位点特异性PCR方法,用于鉴别金银花和其常见伪品以及两者的混杂品.方法:通过对GenBank收录的忍冬属植物叶绿体trnL-trnF序列进行对比分析,获得金银花真伪鉴别SNP位点;并依据该SNP位点设计特异性引物,对84份金银花基原植物及其市售饮片、伪品进行双向位点特异性PCR扩增,并根据真伪品的特异性条带进行金银花药材鉴别.结果:退火温度为61℃时,正品均出现468 bp的条带,红腺忍冬、华南忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬、金银忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9个伪品均出现324 bp的条带,在正品DNA中掺入5％以上伪品时同时出现正品和伪品条带.结论:双向位点特异性PCR可以鉴别金银花真伪品及两者的混杂样品.     

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测中药材蜈蚣真伪＊

目的 建立少棘巨蜈蚣的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的方法，以实现对市场蜈蚣药材真伪的快速检测。方法 针对少棘巨蜈蚣COI序列设计专属性LAMP引物；考察恒温条件下最佳反应时间；通过对DNA模板的梯度稀释，确定LAMP反应对蜈蚣药材的最低检测浓度；对少棘巨蜈蚣及其伪品进行LAMP扩增反应，以考察LAMP引物对少棘巨蜈蚣的特异性。结果 筛选得到了一套特异性较好可用于检测少棘巨蜈蚣的LAMP引物，LAMP反应最佳反应时间为30 min，皮克级别的DNA就能被显著检出。结论 LAMP反应对于少棘巨蜈蚣的检测显示了良好的特异性，使用简便，有用于指导市场流通过程中蜈蚣药材的快速检测的潜力。     

少棘蜈蚣的DNA指纹图谱鉴别研究

目的：建立基于2个引物组合的DNA指纹图谱技术,鉴别少棘蜈蚣药材及其混伪品。方法：收集蜈蚣属少棘蜈蚣及11个易混淆种共39批样品,使用通用鉴别引物12S-L1091/12S-H1478和16S-L3428/16S-H3667扩增并进行短串联重复序列（STR）分型,获得DNA指纹图谱。结果：少棘蜈蚣12S迁移峰为420.1 bp或424.7～426.8 bp,16S迁移峰为175.5～175.6 bp,均不同于其他物种。结论：基于荧光STR分型原理建立了一种简单快捷、可用于蜈蚣药材及其混伪样品的通用DNA指纹图谱鉴别,能够完成对少棘蜈蚣药材的鉴定,并且通过2个引物结合能够鉴别蜈蚣属其他物种。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法 根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同Taq酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。结果 PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。     

基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

蜈蚣药源调查及商品鉴定

通过药源调查和对口药材鉴定,确定蜈蚣药基原动物为少棘蜈蚣、多棘蜈蚣、墨江蜈蚣及黑头蜈蚣。主流商品为少棘蜈蚣,产量约占95％。列出原动物形态特征检索表及药材商品性状检索表,予以鉴别。     

蛤蚧真伪鉴定试剂盒的研制与性能评价

目的 蛤蚧作为我国的名贵中药材，资源少，市场需求量大，导致市场常有混伪品出现，因此研制蛤蚧真伪鉴定试剂盒，为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法 以蛤蚧细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)为靶基因，设计特异性引物，确定合适的PCR反应条件，研制蛤蚧真伪鉴定试剂盒。结果 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，正品可以扩增出约250～500bp之间(473bp)的扩增条带，而伪品无蹼壁虎和石龙子均没有条带。结论 研制出的蛤蚧真伪鉴定试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，适用范围广，操作简单，结果准确，可以为蛤蚧的DNA分子鉴别提供技术保障，可以保证药源无误，药效可靠。     

基于物种特异性PCR方法的鸡内金真伪鉴别

目的:建立鉴别鸡内金及其常见伪品的物种特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,对全国中药材及饮片专项抽验任务中所抽取的鸡内金饮片进行真伪鉴别,评价市场上鸡内金的真伪情况。方法:根据鸡、鸭、鹅的12S序列差异,设计或优化物种特异性PCR鉴别引物,对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶种类等进行方法学考察和优化。使用优化的特异性PCR方法对鸡、鸭、鹅内金样品进行DNA分子鉴别。结果:在进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为55℃,循环次数为30次的条件下,当使用文中筛选得到的鸡物种特异性鉴别引物时,所测鸡内金饮片均检出约为273 bp的特异性扩增条带,混伪品鸭内金和鹅内金均无相应扩增条带;当使用鸭和鹅鉴别引物时,均未检出相应的扩增条带。结论:位点特异性PCR方法能够快速准确的鉴别出鸡内金真伪品,可用于全国中药材及饮片专项抽验任务中鸡内金的真伪鉴定,目前市场上用鸭内金和鹅内金充鸡内金现象较少,质量评价较好。     

基于12S基因对中成药中药用乌梢蛇的分子鉴定研究

目的 建立一种适用于中成药中乌梢蛇药材掺伪问题的分子鉴别方法。方法 收集组方有乌梢蛇的中成药11种、乌梢蛇及其混伪品15种。对所有样品进行总基因组DNA提取,基于12S基因片段对乌梢蛇及其混伪品对比分析,根据差异位点设计乌梢蛇通用引物序列、特异引物序列以及荧光定量所用引物和探针,分别采用不同聚合酶链式反应(PCR)方法扩增乌梢蛇药材及中成药中乌梢蛇成分,优化反应体系并对方法进行耐受性和适应性的考察。结果 建立了乌梢蛇的特异性PCR技术,乌梢蛇正品均在200 bp附近处有一清晰条带,其他混伪品无条带。建立荧光定量PCR鉴别方法,适用于DNA含量低的中成药检测。结论 通过特异性引物PCR扩增可以有效鉴别乌梢蛇药材,通过荧光定量PCR检测法可以有效鉴别乌梢蛇药材及中成药中乌梢蛇的真伪问题。方法具有特异、快速、灵敏的特点,为乌梢蛇及中成药中乌梢蛇药材的真伪鉴别提供参考。     

少棘蜈蚣多肽药用价值的研究进展

少棘蜈蚣Scolopendrasubspinipesmutilans已有千年的药用历史,现代研究表明其药用活性成分主要为多肽。随着研究的不断深入,越来越多的具有不同药用潜能的多肽从少棘蜈蚣中发掘出来,这些多肽在抗微生物、抗肿瘤、心血管疾病、自身免疫疾病、镇痛等方面展现出良好的治疗潜能,为新药的设计与开发提供了候选或前体分子。针对具有良好药用前景的少棘蜈蚣多肽的药理活性及作用机制进行阐述,以期为相关药物的研发提供参考。     

中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究

利用DNA条形码技术对蜈蚣药材进行鉴别,为蜈蚣药材鉴定提供新的方法。该研究以COI条形码序列为基础,对蜈蚣实验样品进行DNA提取,PCR扩增和双向测序,用MEGA6.0软件对所有5个物种的50份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果显示实验样品均可以获得COI序列,蜈蚣药材与其混伪品COI序列种间平均K2P距离为0.222,种间最小K2P 距离为0.190,基于COI序列构建的邻接（NJ）树中少棘巨蜈蚣单独聚在一枝,与其混伪品可以相互区分。因此基于COI条形码序列可以准确鉴定蜈蚣及其混伪品。     

中药蜈蚣毒溶血活性试验

通过溶血试验对活体少棘蜈蚣,药材少棘蜈蚣和多棘蜈蚣的粗毒进行溶血活性比较。结果表明均有溶血活性,且药材蜈蚣毒活性较活体蜈蚣大大降低,陈药材蜈蚣毒活性较新鲜药材降低一倍,多棘蜈蚣毒活性明显高于少棘蜈蚣。     

哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列分析

[目的]获取哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列。[方法]应用差速离心以及滚环扩增的方法得到纯度较高的线粒体DNA,采用Illumina HiSeq X Ten技术对扩增得到的哈氏蜈蚣线粒体DNA进行测序,采用从头组装和mapping近缘种的方法拼接组装线粒体基因组,应用MITOS在线注释及与近缘种进行本地注释等方法注释线粒体基因组。[结果]获得14 538 bp哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列。其共有20个tRNA及13个蛋白基因,2个rRNA(16S rRNA、12S rRNA)。[结论]获取哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列,并可用于药用蜈蚣的资源调查与保护研究。     

地龙及其混淆品原动物的形态及DNA双重条形码鉴定

目的基于线粒体cytochrome coxidase I(CO I)和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定

目的:建立柴胡及其伪品DNA指纹鉴别方法.方法:采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA,设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物,利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定.结果:改良的CTAB法提取出大小为23 kb的基因组DNA条带,纯度在(1.71±0.11),且经特异引物PCR扩增,只有正品柴胡能扩增出173bp大小的片段,而伪品未能扩增出目的片段.结论:柴胡DNA具有特异性指纹特征,可作为市售柴胡的真伪鉴定依据.     

黑头蜈蚣的化学成分

本文报道了黑头蜈蚣Scolopendra negrocapitis化学成分,并与中国药典收载的少棘巨蜈蚣S.subspinipes mutilans进行了比较。黑头蜈蚣含总脂18.7％,蛋白质63.4％,游离氨基酸11.9％;含有与少棘巨蜈蚣相同的12种脂肪酸(其中不饱和脂肪酸占64％),21种氨基酸和12种微量元素;蛋白质聚丙酰胺凝胶电泳分离出14条色带。表明黑头蜈蚣与少棘巨蜈蚣主要化学成分类同,是一种值得开发利用的新药源。