多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

微流芯片检测流感病毒多重逆转录聚合酶链反应产物的实验研究

[目的 ]　建立应用微流芯片检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)产物的方法 ,在mRT -PCR扩增核酸的基础上自动化灵敏的定量检测扩增产物 ,快速检测甲亚型、乙型流感病毒 ,帮助临床快速诊断和鉴别诊断其他呼吸道病毒感染 ,以及明确流感病毒在人群中感染、流行情况。　 [方法 ]　采用经MDCK细胞分离培养的甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒毒株病毒液 ,使用 3组特异引物经mRT -PCR扩增核酸 ,扩增产物分别采用毛细管电泳技术经Caliper10 0 0微流芯片分析仪自动化检测和经 2 %琼脂糖凝胶电泳法检测。　[结果 ]　设计三组引物对相应甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒靶基因的mRT -PCR扩增产物片段分别为 43 0bp、2 10bp、3 91bp ,本实验mRT -PCR扩增产物经 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,与Marker比照 ,DNA条带基本在此位点附近 ;产物采用毛细管电泳法经Caliper10 0 0微流芯片分析仪后 ,分别于 413bp、2 0 3bp、3 79bp处出现陡峭的峰 ,如图所示。　[结论 ]　应用微流芯片采用毛细管电泳法可对流感病毒mRT -PCR产物进行定位及相对定量 ,有助于快速诊断流感病毒感染 ,有助于对流感的监测。     

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒HA基因的HA1片段,得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的HA基因的HA1片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物,用多重逆转聚合酶链反应能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒HA基因的HA1片段,根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感疾病。结论 多重逆转聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。     

直接免疫荧光法与多重逆转录聚合酶链反应对呼吸道感染常见病毒的诊断价值

目的 探讨直接免疫荧光法(DFA)和多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对呼吸道常见病毒人鼻病毒(HRV)感染患者分泌物的检测,判断其临床诊断价值.方法 选取2010年2月-2011年12月收集的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物210例,分别用DFA和RT-PCR进行检测,对两组测定方法的检测结果进行判定.结果 多重RT-PCR检出112份阳性标本,阳性率为53.33％,DFA检测出89份阳性标本,阳性率为42.38％,两组比较,差异有统计学意义(x2=27.623,P＜0.01).结论 DFA检测方法可以广泛适用于临床检测中;多重RTPCR检测方法的敏感性高,检测病毒的范围广,可以做亚型鉴定方法,适用于呼吸道病毒流行病学的调查研究.     

多重聚合酶链反应检测儿童常见下呼吸道感染细菌

目的 探讨多重聚合酶链反应(PCR)检测儿童急性下呼吸道感染细菌的应用价值.方法 对383例急性下呼吸道感染患儿的深部呼吸道吸引物进行细菌培养及多重PCR检测,检测肺炎链球菌、流感嗜血菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌等9种病原菌.结果 细菌培养的总检出率为42.04％,多重PCR检出率45.95％,两者差异无统计学意义;以细菌培养为标准,多重PCR检测的总敏感性为77.02％,特异性为76.58％,其中大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的检出率明显高于培养法.结论 多重PCR检测可作为下呼吸道致病菌快速检测的有用工具.     

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的：建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的H基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp,1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1，甲3和乙型流感病毒有稳定对应的关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。结论：多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。     

多重逆转录-聚合酶链反应检测麻疹风疹流行性腮腺炎病毒基因的研究

目的　探索麻疹、风疹、流行性腮腺炎 (腮腺炎 )病毒感染的快速诊断方法。方法　利用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)方法对麻疹、风疹、腮腺炎病毒的相关基因检测进行研究。结果　直接从麻疹疫苗沪1 91 株 ,风疹疫苗BRDⅡ株 ,腮腺炎疫苗S79株 ,冻干麻疹、腮腺炎、风疹联合减毒活疫苗及临床麻疹、风疹、腮腺炎患者的标本中 ,同时检测出麻疹、风疹、腮腺炎病毒 6 3 5bp、4 1 1bp、5 1 9bp的特异性核酸片段 ,MRT PCR 1次扩增灵敏度均可分别达到 1TCID50 。结论　该方法能特异、敏感地检测临床标本中麻疹、风疹、腮腺炎病毒 ,是快速诊断麻疹、风疹、腮腺炎病毒感染的理想方法     

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

逆转录-聚合酶链反应检测风疹病毒基因

针对风疹患者发病早期血清中特异性风疹IgM抗体阳性率低的特点 ,以及对胎儿风疹病毒感染检测的需要 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)直接从风疹减毒活疫苗BRDⅡ株、风疹GOS株、临床风疹患者的含漱液和咽拭子中检测出 411bp特异性片段 ;而麻疹、流行性腮腺炎、流行性感冒病毒均未检测出相应片段。通过对RT PCR一次产物的再次扩增 ,可以使检测的灵敏度达到 0 1TCID50 。该技术可作为风疹酶联免疫吸附试验 (ELISA)的一种补充 ,同时对控制先天性风疹综合征与优生优育工作具有积极的作用。     

多重聚合酶链反应检测流感嗜血杆菌

目的 建立检测流感嗜血杆菌的多重聚合酶链反应(M-PCR)方法 .方法 合成扩增流感嗜血杆菌编码P6外膜蛋白基因的引物(Hi),鉴定流感嗜血杆菌种特异性;合成扩增流感嗜血杆菌编码荚膜基因的引物(Hi-cap),鉴定菌株是否具有荚膜;设计并合成6对扩增流感嗜血杆菌不同血清型(荚膜型)编码摹因的引物(Hia-Hif),鉴定菌株的血清型,以其他呼吸道常见病原体菌株做对照,应用M-PCR方法 对200株临床分离的疑似流感嗜血杆菌菌株进行鉴定和血清分型.结果 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有高度的敏感性和特异性.对照菌株应用种(Hi)、荚膜(Hi-cap)和荚膜型(Hia-Hif)特异引物没有扩增出DNA片段.M-PCR方法 检测DNA的最低检测量为0.935 Pg.对临床分离的200株疑似流感嗜血杆菌鉴定,189株为流感嗜血杆菌,与API R NH鉴定结果 一致.其中1株具有荚膜,为f血清型,与玻片凝集法鉴定结果 一致.结论 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有较高的敏感性和特异性,可用于流感嗜血杆菌感染病例标本的快速检测和病例诊断.     

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。     

甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用

目的研究甘草抗病毒活性成分（GX）体外抗呼吸道合胞病毒（RSV）的作用。方法采用中性红实验和观察细胞病变（CPE）法,以利巴韦林为阳性药,测定GX对RSV的抑制作用。结果GX的半数中毒浓度（TC50）为460.00μg/ml,半数有效抑制浓度（EC50）为23.53μg/ml,治疗指数（TI）为19.55;GX在RSV感染Hela细胞2,4,6,8,10 h后给药,对RSV复制均有明显的抑制作用（P〈0.01）;且GX对RSV有中和作用。结论GX在体外对RSV复制有明显的抑制作用。     

孟鲁司特对毛细支气管炎患儿血清IL-6和 IL-10水平的影响

目的 探讨孟鲁司特对呼吸道合胞病毒（RSV）毛细支气管炎患儿血清白介素–6（IL-6）和白介素–10（IL-10）水平的影响及疗效观察。方法 选择80例RSV毛细支气管炎患儿,随机分为实验组和对照组。两组患儿均予以抗病毒、布地奈得雾化吸入及对症支持治疗,症状消失后停药。实验组在此基础上予以孟鲁司特咀嚼片2．5mg,睡前口服,连用3个月。对照组除不使用孟鲁司特咀嚼片外,余治疗同实验组。观察两组患儿治疗前和治疗3个月后的血清IL-6和IL-10水平的变化,并随访观察治疗后半年和1年内喘息复发率。结果 两组患儿治疗前血清IL-6和IL-10水平比较差异无统计学意义（t＝0．19,P＞0．05）。治疗3个月后,两组患儿血清IL-6水平均显著下降（t值分别为2．95、2．26,均P＜0．05）,IL-10水平均显著上升（t值分别为2．91、2．35,均P＜0．05）,且实验组患儿IL-6水平显著低于对照组（t＝2．31,P ＜0．05）,IL-10水平显著高于对照组（t＝2．21,P＜0．05）。实验组治疗后随访观察半年和1年内其喘息复发率均明显低于对照组（χ^2分别为4．50、5．23,均P＜0．05）。结论 孟鲁司特治疗RSV毛细支气管炎的疗效确切,能明显能减少喘息的复发率,作用机制与其降低血清IL-6水平,升高血清IL-10水平,调节血清炎症因子水平失衡密切相关。     

婴儿呼吸道合胞病毒急性下呼吸道感染的相关因素分析

目的：探究影响婴儿呼吸道合胞病毒急性下呼吸道感染的相关因素。方法选取2013年7月至2014年7月于浙江省金华市浦江县人民医院住院的急性下呼吸道感染（ ALRI）患儿1540例，根据浙江省金华市浦江县人民医院呼吸道合胞病毒（RSV）检测结果，将患儿分为RSV阳性组（n＝816）和RSV阴性组（n＝724）两组，对比两组患者的性别、年龄、出生体重、胎龄、发病季节、合并基础疾病、合并先心病、居住人口、家庭月收入、母乳喂养、家庭吸烟、妊娠合并糖尿病、妊娠合并高血压、孕母特应性疾病等。结果多因素分析发现，秋冬季节发病（OR＝1．579，95％CI＝1．172～2．127）、合并先心病（OR＝1．317，95％CI＝1．028～1．685）、孕母特应性疾病（OR＝1．802，95％CI＝1．235～2．631）是婴儿RSV相关ALRI的危险因素，而家庭月收入≥10千元（OR＝0．679，95％CI＝0．499～0．924）是其保护因素。结论秋冬季节发病、合并先心病、孕母特应性疾病的婴儿RSV相关ALRI发病率高，而家庭月收入≥10千元的家庭RSV相关ALRI发病率低。     

RSV感染足月新生儿肺炎临床表现及实验室检查分析

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSv)感染足月新生儿肺炎的临床表现及实验室检查结果的特点.方法 随机选取2013年1月至2015年12月义乌市妇幼保健计划生育服务中心儿科收治的足月新生儿肺炎患儿200例,采用直接免疫荧光法对其进行RSV抗原检测,根据检测结果将其分为RSV阳性组和RSV阴性组,分析两组患儿的临床表现及实验室检查结果.结果 在200例足月新生儿肺炎患儿中,RSV阴性组179例,RSV阳性组21例,感染率达10.50％.两组在喂养方式、分娩方式及年龄上的差异均有统计学意义(x2值分别为4.084、29.007、2.229,均P＜0.05).两组患儿的喘鸣音、细湿性啰音、三凹征、呼吸急促及咳嗽发生率比较差异均有统计学意义(x2值分别为13.195、34.641、15.590、17.378、3.979,均P＜0.05).RSV阳性组患儿x线胸片出现斑片影的比例较RSV阴性组明显降低,而出现肺气肿的比例则明显高于RSV阴性组,经比较差异均有统计学意义(x2值分别为9.926、67.427,均P＜0.05).在治疗与转归方面,患儿全部使用了抗生素,均治愈.结论 足月新生儿感染性肺炎的主要病原体是RSV,顺产及母乳喂养均可在一定程度上降低足月新生儿感染RSV的风险.该类感染性肺炎在临床表现上更易出现肺部啰音、呼吸急促及咳嗽,肺气肿表现则在X线胸片检查上更容易出现.     

2009-2010年上海市儿童呼吸道病毒病原谱的建立和分析

目的应用多重PCR检测方法对上海市儿童呼吸道病毒感染进行检测,获得疾病谱分析其流行规律。方法 2009年1月到2010年3月上海市儿童医院因呼吸道感染住院病人下呼吸道标本519份,利用多重PCR技术进行12种常见呼吸道病毒的检测。结果在591例标本中病毒阳性率是58%(301/519)。其中呼吸道感染患儿中呼吸道合胞病毒B(RSVB)占首位,为37.5%(113/301),其次是鼻病毒(HRVA/B),为17.3%(52/301),比例最低的是副流感病毒2(PIV2),比例仅为0.7%(2/301)。人偏肺病毒(HMPV)的比例为6%(18/113)。结论 RSVB HRVA/B和PIV3以及Adv是上海市儿童呼吸道疾病感染的主要病原,混合感染以HRVA/B联合其他病毒为主。     

吉林省2010年7-12月上呼吸道感染病毒病原学检测结果分析

目的了解2010年吉林省地区急性上呼吸道感染患者5种呼吸道病毒感染情况,为以后的急性呼吸道感染监测做出指导。方法采集门诊就诊的456例患者咽拭子标本,对其进行核酸提取后,采用(RT)-PCR方法检测甲型流感病毒(IVA)、呼吸道合胞病毒(RSV)A/B、副流感病毒(PIV)1-4型、腺病毒(ADV)以及博卡病毒(HBoV)等5种常见呼吸道病毒。结果检测出阳性标本92例,阳性率20.18%,以流感病毒感染阳性率(8.11%)最高。结论 2010年7-12月吉林省地区上呼吸道感染主要以流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒为主。其中流感病毒感染居首位。