结核杆菌H37Rv株重组KatG蛋白的表达纯化研究

目的表达纯化结核杆菌H37Rv株重组KatG（简称rKatG）蛋白，为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法重组质粒pET23b—KatG转化大肠埃希菌表达菌株BL21（DE3）plysE,IPTG诱导rkatG蛋白表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后，优化表达条件，用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rKatG蛋白，对纯化产物进行过氧化氢酶活性测定。结果成功构建了重组质粒pET、23b-KatG,rKatG蛋白以可溶性蛋白形式表达，经亲和层析后的rKatG蛋白纯度为95．6％，过氧化氢酶试验阳性。结论构建的pET23b-KatG重组质粒能高效表达有酶活性的可溶性rKatG蛋白，经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白。     

蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蓝氏贾第鞭毛虫的α-4贾第素蛋白。方法经RT—PCR获得a-4贾第素基因片段,经双酶切连入原核表达载体pET-28a（＋）,构建成为重组表达载体pET-28a（＋）-α-4,并转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。IPTG诱导后,收集菌体,裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并用Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了原核表达载体pET-28a（＋）-α-4,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在;SDS-PAGE及Western blot分析显示,在相对分子量约34kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni—NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的重组的α-4贾第素融合蛋白。结论成功克隆、表达并纯化了α-4贾第素蛋白,为α-4贾第素的细胞定位及功能研究提供了必要条件。     

肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌（H.hepaticus）甲基基团接受趋化信号转导蛋白（MCP）基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b（＋）,构建MCP的原核表达质粒pET22b＋/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b＋/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化北大核心CSCD

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

梅毒螺旋体蛋氨酸亚砜还原酶的原核表达、纯化及其抗氧化功能研究

目的原核表达、纯化梅毒螺旋体(Treponema pallidum)蛋氨酸亚砜还原酶(Methionine sulfoxide reductase,Msr)并测定其抗氧化功能。方法将TpMsr基因连接到表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-TpMsr,热激法将其转化大肠埃希菌BL21(DE3)得到重组菌BL/pET28a-TpMsr,IPTG诱导重组TpMsr蛋白表达。利用镍柱亲和层析纯化目的蛋白,采用比色法测定Tp Msr蛋白的酶活性。采用菌落计数法测定重组大肠埃希菌在H2O2胁迫下的存活率。结果成功构建重组质粒pET28a-TpMsr,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后高效表达分子质量单位(Mr)约34.8×103的TpMsr,经Ni 2+柱亲和层析纯化得到高纯度的重组TpMsr蛋白。该蛋白能将蛋氨酸亚枫还原为蛋氨酸,且能赋予大肠埃希菌抵抗氧化应激的能力。结论构建的重组质粒pET28a-TpMsr能表达TpMsr蛋白。该蛋白具有抗氧化功能,为研究梅毒螺旋体的抗氧化机制提供了实验依据。     

重组结核杆菌热休克蛋白Acr2的原核表达、纯化及鉴定的研究

目的原核表达、纯化结核杆菌热休克蛋白Acr2分子,并分析其免疫反应性。方法采用PCR法扩增结核杆菌Acr2基因,并构建重组表达质粒PET22b-Acr2,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,并用IPTG诱导Acr2蛋白表达。以及使用镍离子亲和层析柱纯化该表达产物,并通过Western blot检测其免疫反应性。结果 PCR、双酶切和测序结果均表明PET22b-Acr2重组质粒构建成功,其在大肠埃希菌中主要以包涵体蛋白形式进行表达。复性后的包涵体蛋白经镍离子亲和层析柱纯化后,可获得纯化的Acr2重组蛋白,该重组蛋白分子质量约为18.3ku,与结核分枝杆菌Acr2蛋白的理论预测值相符。经Western blot检测显示该重组蛋白能被结核病人血清特异性识别。结论原核表达质粒PET22b-Acr2被成功构建,以及Acr2重组蛋白被有效进行表达和纯化,从而为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人胰腺癌 Hedgehog 信号通路中膜蛋白受体 PTCH 的纯化

目的 构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达.方法 从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA,经RT-PCR扩增出PTCH基因,经纯化、回收目的 基因PTCH,将其插入表达载体pET22b,转化E. Coli BL21-CodonPlus(TM)-RP,构建重组质粒pET22b/PTCH,IPTG诱导表达融合蛋白,免疫印迹进行鉴定,Ni-螯合亲和层析纯化融合蛋白.结果 从人胰腺癌细胞株SW1990克隆出长为789 bp PTCH目的 片段,成功构建重组质粒pET22b/PTCH,并诱导表达目的 蛋白;经Ni-螯合亲和层析得到纯化的融合蛋白.结论 成功构建了重组质粒pET22b/PTCH,并获得纯化的融合蛋白,为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具.     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定

目的 构建包含HCV核心蛋白全长基因的重组原核表达质粒,经转化表达型大肠杆菌后自诱导培养以获取可溶性重组核心蛋白,并检测其生物学功能. 方法 以H/FL质粒为模板,通过PCR扩增全长HCV核心蛋白DNA.PCR产物经双酶切后定向克隆到pET28a原核表达载体中.将重组的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS,并通过自诱导培养的方式使其在高浓度状态下表达重组核心蛋白.重组核心蛋白经Western blot检测鉴定生物学功能,并与HCV NS3蛋白进行相互结合后共同纯化实验. 结果 重组核心蛋白大量存在于表达菌破菌上清液中.Western blot检测结果显示其具有核心蛋白抗原性.重组核心蛋白不能单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,但可以与HCV NS3蛋白结合后共同纯化. 结论 成功表达可溶性的重组核心蛋白,证明了其生物学活性.重组核心蛋白与HCV NS3蛋白存在相互作用.     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

4种血清型登革病毒多表位重组抗原的表达及血清学初步评价

目的在原核表达系统中对登革病毒包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白1(NS1)融合的B细胞抗原表位进行表达、纯化及血清学评价。方法将B细胞抗原表位用形成α螺旋的连接肽(EAAAK)2作为接头,串联合成1条全新的多表位融合重组基因rE,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白,用镍柱对重组蛋白纯化,并用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。以融合蛋白为抗原,用间接ELISA检测登革热病人血清IgM抗体。结果重组表达载体pET28a-rE构建成功,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,用镍柱纯化获得高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符,建立的间接ELISA具有较高的准确性。结论原核表达的登革病毒多表位融合蛋白具有良好的血清学检测价值。     

牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析

目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因（LDH）进行克隆、表达和免疫原性分析。 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a（+）中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET-30a（+）-TaLDH构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml。Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr)35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性。 结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达。     

裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析

目的 通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法 将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果 所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论 成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。     

埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达获得埃博拉病毒科特迪瓦型的重组核蛋白,并将蛋白纯化。方法将合成的埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白基因亚克隆入原核表达质粒pET-28（a）中,构建重组表达质粒pET-28（a）-C-NP,并将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析表达蛋白及表达量,并用利用His-Band Ni＋柱进行亲和层析纯化,Western blot和蛋白序列分析鉴定表达蛋白。结果所构建的重组表达质粒pET-28（a）-C-NP序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白表达,表达蛋白正确。结论成功表达并纯化了埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 构建粉尘螨6类变应原（Dermatophagoides farinae，Der f6）基因的高效原核表达载体，并进行表达、纯化及生物学功能分析。 方法 根据Der f6基因已知序列，设计1对引物，通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段，PCR产物克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希菌（E.coli Top10），经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养，碱裂解法提取质粒，所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化后连接并转化至E.coli Top10。构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后，再转化至E.coli BL21（DE3）， 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果，用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白。 结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6。SDS-PAGE 结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3）中获得良好的表达，所得重组蛋白相对分子质量(Mr) 为31 000, 与理论值一致, 经亲和层析纯化后，SDS-PAGE 结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting, 结果表明具有良好的IgE结合活性。 结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6。     

亚洲牛带绦虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因(Ta PITPα),探索其应用前景。方法将亚洲牛带绦虫成虫PITPα克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta PITPα重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和感染了亚洲牛带绦虫的猪血清识别,表明其具有免疫活性。结论亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因可在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。