石蜡包埋组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

目的探讨结核患者石蜡包埋组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证。方法 20份4%甲醛固定石蜡包埋的肺或淋巴结结核组织标本,分别以氯化钠盐析法、酚-氯仿抽提法、一步法、试剂盒法提取其DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)及膜芯片法分析所提取DNA的质量。结果氯化钠盐析法提取的DNA〔(19.338±6.270)μg〕和一步法提取的DNA〔(20.050±5.591)μg〕最多(P<0.001),一步法的A260/A280比值(1.044±0.137)明显低于其他3种方法(P<0.001);电泳结果显示4种提取方法均得到了基因组DNA;PCR与膜芯片验证显示除一步法外其余3种方法提取的DNA中均检测到结核杆菌DNA。结论氯化钠盐析法提取石蜡包埋组织结核杆菌DNA具有高效简便的特点,是较为理想的方法。     

两种机会性寄生原虫——微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫基因检测方法的建立

目的建立两种机会性寄生原虫——微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫（贾第虫）基因检测方法。方法从微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫感染者粪便标本内分离纯化卵囊和包囊，提取基因组DNA。根据微小隐孢子虫18S rRNA基因和贾第虫磷酸丙糖异构酶（tim）基因各设计或合成两对特异性引物，采用PCR技术分别对从卵囊和包囊提取的和6种对照DNA样本（日本血吸虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、旋毛虫和阴道毛滴虫以及人体血细胞DNA等），以及此二种虫相互间的DNA样本进行检测，以确定该法的特异性和敏感性。方法建立后，取艾滋病患者粪便标本对之进行检测。结果从微小隐孢子虫和贾第虫的DNA样本中分别扩增出各自相应基因的500bp和683bp长度的片段；最少可检测出20pg隐孢子虫和0．4pg贾第虫DNA；几种对照DNA样本均不发生交叉反应；受检的30例艾滋病患者粪便标本中，7例显示微小隐孢子虫阳性，未检出贾第虫。结论建立的基因检测方法，对微小隐孢子虫和贾第虫的检测具有高度的特异性和敏感性，可用于临床艾滋病合并感染的早期诊断和人群流行病学筛查。     

一种非致死提取单头家蝇基因组DNA的简便方法

目的家蝇是一种广泛分布的重要公共卫生害虫,开展其遗传学、分子生物学的研究为认识和利用家蝇、有效地控制蝇传疾病提供科学依据。遗传学、分子生物学的研究常需要用到DNA样品和聚合酶链反应(PCR),建立一种简单快速的DNA提取方法,为研究工作提供极大的便利。方法剪取家蝇的双翅或后足置于提取液中,温育1h后获得家蝇基因组DNA的样品;以此基因组DNA为模板,扩增CYP6D1v1基因;测定去翅或去后足的家蝇繁殖能力。结果基因组DNA成功地从家蝇个体的双翅或后足中提取,此DNA制备液可直接用于PCR扩增;剪除双翅或后足对家蝇个体无致命损伤,不影响家蝇的正常繁殖。结论该方法快速、简便、有效且样品非致死,提取的DNA可以应用于诸如用PCR法鉴定个体基因型等的后续分析。     

石蜡包埋的石棉肺癌组织的基因组DNA的快速提取法

建立了从少量石蜡包埋的组织切片中快速提取石棉肺癌组织中的基因组ＤＮＡ的水煮脱蜡法，克服了传统的二甲苯脱蜡法的周期长、成本高和毒性大的缺点。所得到的基因组ＤＮＡ中，长片段占较大的比例，总量可足够用作１０～２０次ＰＣＲ扩增反应的模板，并可用于其它分子生物学研究     

人血凝块提取基因组DNA碘化钾法建立

目的 通过与酚/氯仿法比较,建立一种快速、经济、高效从人血凝块提取基因组DNA的简易方法.方法采用双蒸水低渗破碎红细胞,碘化钾直接、快速裂解白细胞及其核膜,氯仿/异戊醇沉淀蛋白质及残存细胞碎片,最后经异丙醇和乙醇沉淀基因组DNA.结果 采用该法提取的基因组DNA浓度为(46.4±8.8)mg/L,吸光度值A260/A280为(1.79±0.23),与酚/氯仿法(46.1±8.3,1.78±0.22)比较差异无统计学意义(P>0.05);2种方法 提取基因组DNA凝胶电泳条带完整,PCR扩增目的 条带完整,能够满足分子生物学实验要求.结论 碘化钾法是一种快速、简便、经济、高效提取人血凝块基因组DNA的方法,可以广泛运用于大规模人群基因组学研究.     

石蜡包埋组织中4种DNA提取方法的比较研究

目的 探讨石蜡包埋组织中提取DNA的简易有效方法.方法 取我院2003年肿瘤细胞减灭术切除的10%甲醛固定石蜡包埋的上皮性卵巢癌标本20例,分别以一步法、氯化钠盐析法、酚氯仿抽提法、试剂盒法提取其DNA,然后进行电泳和聚合酶链反应扩增分析.结果 酚氯仿抽提法所得样本DNA的产量为55.12±8.81 μg,氯化钠盐析法为58.39±5.76 μg,两者比较无显著差异(P＞0.05),但分别和另外两组相比有显著差异(P＜0.001);酚氯仿抽提法所得样本DNA的OD 260/OD 280比值为1.81±0.16,氯化钠盐析法为1.84±0.18,两者比较无显著差异(P＞0.05),但分别和另外两组相比有显著差异(P＜0.01);酚氯仿抽提法,氯化钠盐析法所得DNA产量和质量均高于一步法和试剂盒法.结论 蛋白酶K消化氯化钠盐析法简便快捷,不用接触有毒的化学药品,是理想的石蜡包埋组织DNA提纯方法.     

食品中沙门菌特异性二重聚合酶链反应检测方法的研究

目的建立二重聚合酶链反应(PCR)方法快速检测食品中的沙门菌(Salmonella spp.)。方法以沙门菌特异性基因invA、hilA为靶基因,选择2对引物对16株沙门菌和24株非沙门菌进行扩增,验证二重PCR的特异性。梯度稀释DNA,以不同稀释度的DNA PCR扩增。在猪肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果以invA、hilA为靶基因的两对引物对沙门菌的检出均有很好的特异性,PCR能检出0.1332pg的沙门菌DNA,人工污染猪肉的检测限为2.5cfu/ml。本研究共检测了53份食品样品,有21份检出了沙门菌。结论建立了适用于肉类、水产品及蛋糕等食品中的沙门菌检测的快速、灵敏、特异的二重PCR方法。     

微小隐孢子虫pcDNA3.0-23重组质粒免疫效果评价

目的 比较微小隐孢子虫表面抗原CP23真核表达载体pcDNA3.0-23经不同免疫途径产生的免疫效果。方法 提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcD-NA3.0-23重组质粒,分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)免疫2种途径免疫BALB/c小鼠,免疫3次,2周后检测抗CP23特异性抗体IgG滴度、小鼠脾脏、血清中CD4⁺和CD8⁺T细胞、细胞因子γ干扰素(IFN-γ);用微小隐孢子虫攻击感染被免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果 肌注组与滴鼻组小鼠血清抗CP23特异性抗体IgG滴度随免疫次数增加均明显升高,高于对照组及空质粒组(P<0.05),肌注组高于滴鼻组(P<0.05);肌注组与滴鼻组小鼠的CD4⁺T细胞、CD4⁺/CD8⁺比值均高于磷酸缓冲液(PBS)对照组及pcDNA3.0空质粒组(P<0.05),但2种免疫途径的差异无统计学意义(P>0.05);肌注组和滴鼻组脾细胞培养上清中IFN-γ明显高于对照组及空质粒组(P<0.05);微小隐孢子虫攻击小鼠后,2种免疫途径的小鼠排出卵囊量明显少于对照组,且排出时间缩短,2种途径的差异无统计学意义。结论 pcDNA3.0-23重组质粒作为基因疫苗,可产生较好的细胞及体液免疫反应;不同的免疫途径可产生不同的免疫反应。     

基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究

目的：应用PCR技术来实现绿脓杆菌的快速鉴定。方法：绿脓杆菌特异性的PCR扩增引物是根据已报道的ETA基因序列设计的，同时考察该PCR方法的特异性和敏感性。另外，一种不提取基因组DNA而直接制备简易模板的直接PCR方法在本研究中也被尝试。结果：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，仅在包含绿脓杆菌基因组DNA的样品中得到单一条带。直接PCR方法也成功扩增出同样的条带，而整个过程在4h内完成。结论：这种扩增绿脓杆菌ETA基因的直接PCR方法对绿脓杆菌的鉴定来说是一种快速、特异、敏感和相对简单的方法。     

立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法.方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系（R2=0.996）,最低检测浓度为5拷贝/μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性.用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关.结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断.     

采用PCR方法检测Fmr1基因敲除小鼠的基因型

目的为Fmr1基因敲除小鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型Fmr1基因和Fmr1缺陷突变基因的DNA片段,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度,并将所得基因型结果与经典的western blot方法比较。结果野生型仅在800bp处有一条条带,突变纯合子仅在500bp处有一条条带,杂合子则在500bp和800bp处出现两条条带。用PCR方法获得的Fmr1基因分析结果与经典的western blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析Fmr1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。     

多重聚合酶链反应技术诊断疟疾及混合感染的研究

目的建立一种特异、敏感、简便的疟疾聚合酶链反应（PCR）快速诊断方法。方法针对疟原虫SSU rRNA基因序列设计3条分别具有属、种特异性的引物,通过多重PCR反应扩增间日疟原虫和恶性疟原虫不同大小的DNA片段。结果 19份恶性疟原虫血样均扩增出长度为400 bp的特定基因片段,16份间日疟原虫扩增出长度为300 bp的特定基因片段,20份健康人群对照血样经PCR扩增均为阴性。结论该多重PCR检测系统具有高效、敏感、特异、稳定、简便等特点,适宜于大批量样品同时检测,对疟疾的快速诊断、鉴别混合感染有较高的应用价值。     

Hyperimmune bovine colostrum specific for recombinant Cryptosporidium parvum antigen confers partial protection against cryptosporidiosis in immunosuppressed adult mice.

Preparturient cows were immunized three times over a six-week period with recombinant plasmid DNA encoding the Cryptosporidium parvum CP15/60 antigen by injecting the DNA in the mammary gland. Serum was collected at each immunization and first colostrum was collected after parturition; all were assayed for Cryptosporidium-specific antibodies (Ab). A serological response to C. parvum sporozoite and oocyst antigen was detected in cows immunized with pCP15/60 plasmid DNA. Colostrum from these cows, unlike colostrum from normal controls, contained Ab specific for C. parvum sporozoites and oocysts as indicated by immunofluorescence Ab (IFA) staining. Colostrum was also tested for conferring passive immunity against C. parvum infection by oral administration to immunosuppressed adult inbred mice. Immune colostrum and control colostrum were administered to separate groups of dexamethasone (DEX)-treated adult C57BL/6NCr mice beginning 12 h before and at 12 h intervals for 3 days after oral C. parvum oocyst infection. Cryptosporidium development was assayed in ilea of immune- and control-colostrum-treated mice 96 h postinfection by semiquantitative PCR. Mice receiving immune colostrum showed partial protection (about 50% reduction) against intestinal C. parvum development compared to mice receiving control colostrum. This protection was evident at a challenge dose of 10(3) C. parvum oocysts per mouse; no differences were noted in parasite development between groups receiving immune or control colostrum and infected with 10(4) oocysts. This study showed that serum and colostrum Ab response to C. parvum can be elicited in preparturient cows by direct injection of recombinant pCP15/60 plasmid DNA and that passive protection against cryptosporidiosis can be obtained by treating immunosuppressed mice with immune colostrum before and after C. parvum infection.     

PCR技术快速检测痢疾志贺菌的研究

目的快速、准确检测食品中的痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)感染。方法针对痢疾志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)设计引物,通过对PCR扩增体系中dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、酶用量、退火温度和循环数进行优化,建立痢疾志贺菌PCR快速检测方法,并对其特异性、敏感性进行分析。结果该方法检测的特异性好,痢疾志贺菌纯培养物和基因组DNA的灵敏度分别为1.06×102cfu/ml和106.34pg/PCR反应体系;直接检测模拟食品中的痢疾志贺菌,其检出限为3.21×104cfu/ml。结论该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,适用于快速、准确检测食品中致病菌的污染。     

肽核酸生物传感器直接检测临床标本中提取的病毒基因组DNA

目的 以肽核酸生物传感器检测系统直接检测从临床标本中提取的乙型肝炎病毒基因组DNA。方法 抽取63例临床免疫学检测证实为乙型肝炎病毒(HBV)感染者标本血清的DNA，以及15例免疫学检测全阴的标本血清中的DNA，分别用肽核酸生物传感器法以及定量PCR法检测，比较两种方法的优劣并确定传感器法的检测限。结果 传感器法检测60例标本阳性，阳性率为95．24％，而定量PCR法检测63例均为阳性；15例阴性血清两种方法检测均为阴性；传感器法的检测限为8．6pg／L；两种方法检测HBV差异无显著性，但传感器检测法所用时间更短，且无需进行探针的标记。结论 利用肽核酸生物传感器成功地绕过了PCR扩增而直接检测出了临床标本中的HBV基因组DNA。     

Detection of Cryptosporidium parvum oocysts in experimentally contaminated lettuce using filtration, immunomagnetic separation, light microscopy, and PCR

Recovery of Cryptosporidium parvum oocysts in a fecal suspension that experimentally contaminated onto lettuce leaves was investigated. Material recovered from the lettuce samples by washing in detergent solutions were concentrated by filtration using the Envirochek Sampling Capsule. Oocysts were concentrated by immunomagnetic separation (IMS) and detected by microscopy following modified Ziehl-Neelsen (MZN) staining. Cryptosporidal DNA was detected using a nested-PCR assay for amplification of a fragment of the Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene, which was applied to DNA extracted from both filtrates, and material recovered from MZN stained smears on glass slides after microscopy. No Cryptosporidium were detected by microscopy or by PCR of un-inoculated lettuce leaves. After IMS, means of 0-6.5% of the total numbers of oocysts inoculated were recovered and detected by microscopy. Detection by PCR was less sensitive than microscopy. There was a strong association between successful PCR amplification, the numbers of oocysts detected by microscopy and the numbers of oocysts in the inoculum. This study confirms that C. parvum oocysts can be recovered from contaminated lettuce using filtration and IMS, and detected by microscopy and PCR. However, further developments are required to improve recovery of this parasite.     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

不同的DNA提取法对两种常见医院感染菌ERIC-PCR鉴定的影响研究

目的研究不同基因组DNA提取方法,对肠杆菌基因间保守重复序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）鉴定两种菌株的影响。方法采用5种基因组DNA提取法,分别为化学裂解酚/氯仿法、玻珠击打法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法、水煮法对1株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌基因组DNA进行提取,在相同的扩增条件下对不同方法提取的DNA模板进行ERIC-PCR。结果不同菌株基因组DNA经ERIC-PCR扩增后产生不同的电泳图谱,而用不同方法提取同一菌株DNA可以得到非常相似的电泳图谱。结论Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法、水煮法可以作为操作简单的DNA提取法用于细菌基因分型。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。