Let-7b 慢病毒载体构建及对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的影响

目的：探讨Let‐7b过表达和Let‐7b抑制慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向神经细胞分化中的作用。方法构建Let‐7b过表达和Let‐7b抑制慢病毒载体并感染大鼠MSCs ,筛选最适感染复数（MOI）;实验分未感染组、感染组1（感染LV‐rno‐Let‐7b‐up）、感染组2（感染LV‐rno‐Let‐7b‐inhibition）、阴性对照组（感染空病毒）;采用法舒地尔诱导感染后大鼠M SCs分化为神经元细胞。倒置荧光显微镜下观察M SCs感染后荧光表达情况;采用免疫细胞化学染色检测神经元烯醇化酶（NSE）、神经微管结合蛋白（MAP‐2）的表达变化;PT‐PCR检测MAP‐2 mRNA的表达变化;MTT 法检测细胞存活率。结果倒置显微镜下观察大鼠LV‐rno‐Let‐7b‐up和LV‐rno‐Let‐7b‐inhibition慢病毒载体感染成功,MOI值为10,感染3 d时大鼠LV‐rno‐Let‐7b‐up慢病毒感染率最高,细胞存活率较高,感染率可达（92.1±4.3）％;MOI为20,感染5 d时大鼠LV‐rno‐Let‐7b‐inhibition慢病毒感染率最高,细胞存活率较高,感染率可达（90.3±4.2）％。法舒地尔可以诱导MSCs向神经细胞分化,感染组1诱导MSCs为神经细胞显著高于阴性对照组和感染组2,NSE、MAP‐2表达率明显高于阴性对照组和感染组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论结论 LV‐rno‐Let‐7b‐up可更高效感染大鼠 MSCs ,感染LV‐rno‐Let‐7b‐up后大鼠MSCs经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加。     

Neurturin基因在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的构建携带一种神经营养因子Neurturin(NTN)基因的腺病毒(Ad),使其在骨髓基质细胞(BMSCs)中表达。方法采用分子克隆技术,构建携带NTN基因的Ad载体,用脂质体法转染、包装HEK293细胞,制备具有感染活性的Ad-NTN病毒粒子;用病毒上清液感染原代培养的大鼠BMSCs,并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞。用W estern B lot检测转染Ad-NTN的BMSCs细胞上清液。结果经酶切鉴定和DNA测序,得到重组Ad-NTN,对被感染的HEK293细胞进行病毒滴度测定,每毫升病毒贮存液可达1×108.5半数组织培养感染量(TC ID50);将病毒贮存液感染BMSCs,获得了表达NTN的BMSCs,阳性率为65%。W estern B lot检测证实BMSCs上清液中出现特异性NTN条带。结论重组Ad携带的NTN基因能够在BMSCs中表达。     

碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染

背景：以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。 目的：构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达。 方法：实验组：设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine 2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、 包膜质粒pLP/VSVG 共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组：设计GFP基因引物,以GFP- PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。 结果与结论：转染48 h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15 d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。     

hBDNF-GFP基因转染神经干细胞后hBDNF的表达及生物学特性研究

目的 探讨慢病毒载体介导入脑源性神经营养因子(hBDNF)和绿色荧光蛋白(GFP)基因转染大鼠神经干细胞(NSCs)后hBDNF的表达及其生物学特性的变化.方法 构建hBDNF和GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs(hBDNF-GFP-NSCs组),同时设GFP转染NSCs组(GFP-NSCs组)和未转染的NSCs组(NSCs组).应用RT-PCR和Western blot法分别检测3组细胞中hBDNFmRNA和蛋白的表达:ELISA检测hBDNF-GFP-NSCs组细胞转染前后培养液中hBDNF含量的变化:使用上述3组细胞的上清液培养背根神经节(DRG)与NSCs,观察DRG的生长情况并应用流式细胞法检测NSCs分化为神经元的比例.结果 RT-PCR、Western blot结果显示转染后7 d hBDNF-GFP-NSCs组hBDNF mRNA和蛋白的表达均明显强于GFp-NSCs组和NSCs组;EUSA检测显示hBDNF-GFP转染NSCs后上清中hBDNF含量增加,第5天分泌达最高峰,与转染前比较差异均有统计学意义(P<0.05);使用hBDNF-GFP-NSCs组上清液培养DRG和NSCs,4 d后DRG很快伸出突起,流式细胞法检测显示NSCs分化为神经元的比例高于其他两组.结论 NSCs可作为基因转染载体,被hBDNF-GFP基因重组慢病毒转染后仍可保持原有生物学特性,并稳定表达和分泌有生物学活性的hBDNF和GFP.     

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。     

慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子基因的胎儿骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨胎儿骨髓间充质干细胞(fBMMSCs)经慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因后GDNF的表达情况.方法 利用贴壁培养法,从流产胎儿的股骨骨髓中分离培养fBMMSCs,并进行扩增.取第5代fBMMSCs,用慢病毒载体转染GDNF基因.应用免疫组化法及ELISA法检测被转染的fBMMSCs GDNF的表达情况.结果 被转染GDNF基因的fBMMSCs GDNF表达阳性,且培养液中GDNF含量随培养时间延长而增高.结论 被慢病毒转染GDNF基因的fBMMSCs能表达GDNF.     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞***☆

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论：基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

大鼠GAD65基因慢病毒载体的构建及其在MSCs中的表达

目的构建谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)重组慢病毒表达载体,感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行鉴定。方法 PCR法扩增GAD65基因,构建LV5-GFP-GAD65慢病毒载体;与包装质粒共转染293T细胞包装病毒;将慢病毒感染大鼠MSCs,荧光显微镜鉴定转染率,Western blot检测GAD65的表达。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-GAD65慢病毒载体构建成功;包装病毒产生的病毒液滴度为5×107TU/ml;慢病毒感染大鼠MSCs的转染率高于90%,Western blot结果显示GAD65蛋白表达比对照组明显升高。结论 GAD65重组慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染大鼠MSCs能稳定过表达GAD65蛋白,为进一步探索侧脑室注射基因化的MSCs治疗癫痫奠定实验基础。     

Syndecan-1基因沉默抑制胶质瘤A172细胞增殖和侵袭

目的探讨多配体蛋白多糖-1(Syndecan-1,SDC1)在不同胶质瘤细胞株中的表达水平及其沉默对A172细胞的增殖和侵袭的影响。方法通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blotting分析SDC1在不同胶质瘤细胞株中的表达水平;将携带SDC1 sh RNA的慢病毒载体感染A172细胞,稳定沉默的细胞株为干扰组,未转染为阴性对照组,转染scramble序列为空白对照组;采用MTT法、台盼蓝拒然法和流式细胞术检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭力;q RT-PCR和Western Blotting检测相关蛋白变化。结果SDC1在不同的胶质瘤细胞株中表达强度不同,差异具有统计学意义(P0.05)。成功构建稳定沉默SDC1的A172细胞株;与阴性对照组和空白对照组相比,干扰组细胞增殖受到抑制(P0.05),迁移力(58.40±5.24 vs.255.8±16.09、226.5±22.84,F=126.4,P0.05)和侵袭力(61.67±16.26 vs.233.70±17.24、244.30±28.15,F=69.87,P0.05)明显抑制;SDC1、PCNA和MMP-9 m RNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论沉默SDC1基因的表达可抑制胶质瘤A172细胞的增殖、迁移和侵袭,提示SDC1可能成为胶质瘤生物治疗的新靶点。     

再程序化脂肪源性干细胞的制备及体外定向分化为神经元的实验研究

目的制备再程序化脂肪源性干细胞以及探索诱导其定向分化为神经元的方法。方法体外培养脂肪来源干细胞(ADSCs),取纯化、鉴定过的第3代ADSCs接种于24孔板中并分A,B,C三组:A组为带有绿色荧光基因(GFP)的慢病毒载体介导Neurogenin2(Ngn2)基因转染的ADSCs,制备再程序化脂肪干细胞;B组为带有GFP的空载体病毒转染的ADSCs;C组为未进行慢病毒介导基因转染的ADSCs;转基因7d后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15d。光镜下观察各组细胞形态变化以及免疫荧光研究各组ADSCs诱导后定向分化为神经元的差异。结果与B组和C组相比,A组ADSCs转基因后再经诱导分化15d后绝大部分细胞类似神经元,胞体呈梭形或椭圆形,有两个或三个突起伸出,细胞表达神经丝蛋白NF、神经元特异性蛋白NeuN及神经元特异性烯醇化酯酶NSE比例大大提高。B组与C组的神经元分化效率,无显著差异,P>0.05。结论慢病毒介导Neurogenin2基因体外转染ADSCs可以制备出再程序化脂肪源性干细胞,诱导后具有更强的定向分化为神经元的能力。     

神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

小分子干扰RNA介导RhoA沉默优化骨髓间充质干细胞的培养

以往骨髓间充质干细胞的培养方法存在衰老和分化率低等问题。 目的：检测是否可以通过沉默RhoA基因的方法优化骨髓间充质干细胞培养。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组培养：干细胞组(未转染小分子干扰RNA)、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组、经小分子干扰RNA 转染的干细胞组。用RT-PCR,Western blot检测骨髓间充质干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用,采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：与干细胞组、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组比较,经小分子干扰RNA 转染的干细胞组RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多(P < 0.05)。说明通过沉默RhoA基因的方法可以促进骨髓间充质干细胞增殖,优化培养方法。     

Effects of nerve growth factor and Noggin-modified bone marrow stromal cells on stroke in rats

Treatment with bone marrow stromal cells (BMSCs) ameliorates neurological functional deficits after stroke. Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophic factor that supports the survival and growth of neural cells. Noggin, an antagonist of bone morphogenetic protein (BMP), promotes the differentiation of stem cells into neurons. In this study, we hypothesize that transfection of NGF and Noggin in BMSC treatment of stroke promotes BMSC neuronal differentiation and improves functional outcome after stroke. Adenovirus was used to trasfect NGF and Noggin and the transfection efficiency was measured by Western blot and immunostaining in vitro. The transfected BMSCs with NGF and/or Noggin were administered intravenously at 5 days after middle cerebral artery occlusion (MCAo) in rats. The neurological functional outcome and BMSC migration and differentiation in the ischemic brain were measured. The transplantation of BMSCs with NGF or Noggin elicited neurological functional improvement, promoted BMSCs present in the ischemic brain, and also up-regulated neuro-like cell differentiation as well as increased synaptophysin expression in the ischemic brain compared with nontreatment control animals (P< 0.05). Treatment of stroke with a combination of transfection of NGF and Noggin in BMSCs induced a synergistic effect on improved neurological functional outcome, BMSCs present in the ischemic brain, and synaptophysin expression in the ischemic brain compared with BMSCs transfected with an NGF- or Noggin-alone group (P < 0.05). These data demonstrate that increasing NGF or Noggin expression in BMSCs contributes to brain plasticity after stroke and that a synergistic effect is induced on the coexistence of NGF and Noggin in BMSCs treatment of stroke.     

Rapsyn重组质粒转染小鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可能性,并观察Rapsyn蛋白在靶细胞中的表达。方法采用全骨髓贴壁培养法分离纯化C57BL/6小鼠的BMSCs,在体外进行扩增、传代。取第3代细胞,采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至BMSCs中,并置荧光显微镜下观察转染结果;采用Western blot法检测靶细胞中Rapsyn蛋白的表达。结果 BMSCs经转染后24h可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染pEGFP-N1/Rapsyn质粒的BMSCs可稳定表达Rapsyn蛋白。结论利用脂质体介导法可将Rapsyn基因转染至BMSCs中,并能稳定表达Rapsyn蛋白。     

神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

Ad-GFP修饰的间充质干细胞在肺气肿大鼠体内向肺部的定向迁移★

背景：近些年来应用相关干细胞及生长因子促进肺再生修复肺气肿病变的研究逐渐成为热点，那么通过干细胞携带相关外源生长因子基因能否更好的修复肺气肿病变值得关注。 目的：观察携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(adenovirus vecto rmediated green fluorescence protein，Ad-GFP)转染骨髓间充质干细胞的效率、对细胞增殖的影响，及携带目的基因的间充质干细胞尾静脉移植在肺气肿大鼠肺部的定居情况。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离、培养间充质干细胞，流式细胞仪鉴定；在不同感染复数时，激光共聚焦显微镜检测转染效果及转染效率，MTT法检测转染48 h的细胞活性；Wistar大鼠16只，随机分为模型组和对照组，每组8只，采用单纯被动烟熏法制备肺气肿大鼠模型。通过尾静脉移植Ad-GFP修饰的间充质干细胞，于24 h后取大鼠肺组织做快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察间充质干细胞在肺部的分布情况。 结果与结论：实验成功获得大鼠间充质干细胞，Ad-GFP成功转染间充质干细胞，且在MOI=200时，转染效率达到88.42%。在不同MOI下，Ad-GFP转染间充质干细胞对细胞增殖无影响(P > 0.05)。移植24 h后，模型组大鼠及对照组大鼠肺部可见到发绿色荧光的间充质干细胞，且模型组荧光强度明显强于对照组(P < 0.05)。提示导入目的基因可能不会影响骨髓间充质干细胞增殖和归巢特性。     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力*

背景：基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少。 目的：观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响。 方法：贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率。骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组。在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果与结论：重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%。缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05)。缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05)。提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关。     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.