七氟醚预处理对脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接的影响

目的探讨七氟醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(CX-43)以及缝隙连接超微结构的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血对照组(对照组)和七氟醚预处理组。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。脑缺血再灌注24 h后,采用透射电镜观察星形胶质细胞间缝隙连接超微结构的改变;脑缺血再灌注24和72 h后,免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测缺血侧脑组织内CX-43的表达。结果脑缺血再灌注24 h后,对照组仅残留少量缝隙连接,七氟醚预处理组细胞间缝隙连接超微结构完整。脑缺血再灌注24 h后,对照组CX-43含量显著低于七氟醚预处理组(P0.05)。结论七氟醚预处理可能通过减轻脑缺血再灌注损伤后缝隙连接的破坏和CX-43的缺失起到神经保护作用。     

RNAi抑制星形胶质细胞Cx43对缺氧/再复氧后细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术对星形胶质细胞Cx43蛋白的抑制作用以及对细胞缺氧/再复氧后凋亡的影响。方法化学合成针对大鼠Cx43基因的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)及其阴性RNA,通过脂质体转染体外培养原代星形胶质细胞,Western blot检测Cx43蛋白表达情况,MTT法检测siRNA转染对细胞的毒性作用;通过流式细胞术观察抑制Cx43蛋白对星形胶质细胞缺氧/再复氧后细胞凋亡情况的影响。结果 Western blot结果可见,转染siRNA后12h,Cx43蛋白表达开始抑制,48h抑制最明显,MTT结果显示siRNA组和脂质体组的细胞活性明显低于未转染组(P0.05),siRNA组与脂质体组未见明显区别(P0.05);流式细胞术示缺氧12h复氧不同时间,凋亡率逐渐增加,复氧48h凋亡率最高,siRNA干扰组明显低于正常对照组(P0.05)。结论 RNAi技术是研究Cx43功能的一种有效方法,siRNA转染能有效抑制星形胶质细胞Cx43蛋白表达,siRNA转染时,细胞毒性来自脂质体;siRNA抑制Cx43蛋白能够明显减轻星形胶质细胞缺氧/再复氧后的细胞凋亡。     

氧糖剥离对星形胶质细胞CX43蛋白表达及分布的影响

目的探讨氧糖剥离(oxygen-glucose deprivation,OGD)对星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白表达及分布的影响,为急性脑缺血早期临床治疗提供理论基础。方法通过OGD模拟缺血缺氧诱导激活培养的原代星形胶质细胞,采用免疫印迹及荧光显微镜观察缝隙连接蛋白Cx43的蛋白表达变化及细胞内亚分布特点。结果星形胶质细胞经OGD诱导后在再灌12h Cx43表达上调约1.5倍(P0.01),有统计学意义;再灌24h时Cx43表达轻度下调(P=0.13),无统计学意义;在再灌48h其下降约34%,与对照组相比,有统计学意义(P0.01)。同时在再灌24h时可见部分Cx43定位分布到细胞核。结论 OGD导致星形胶质细胞Cx43蛋白表达呈先升高后下降的动态变化并且有部分Cx43蛋白定位到细胞核,提示针对Cx43蛋白的干预治疗应考虑治疗时间窗。     

星形胶质细胞连接蛋白43及其半通道在脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨星形胶质细胞连接蛋白43(Cx43)及其半通道在缺血再灌注(IR)损伤中的作用。方法 32只Wistar鼠被随机分为IR 0 h组、IR 4 h组和IR 24 h组和对照组,每组8只鼠。用免疫组化和Western印迹法检测各组大鼠星形胶质细胞Cx43、半通道抗体1(HC1)和半胱天冬酶3(Casp3)的表达。在氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)0 h,4 h和24 h,用MTT法检测星形胶质细胞活性,用免疫组化和Western印迹法检测Cx43,HC1和Casp3表达的改变。结果大鼠星形胶质细胞中HC1的表达明显少于Cx43的表达。与对照组比较,IR 4 h组大鼠脑组织中Cx43、HC1和Casp3的表达明显增加(均P0.05),而IR 0 h组和IR 24 h组却没有明显的变化。OGDR后星形胶质细胞cell line和Psup细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达在OGDR 4h组明显高于对照组(均P0.05),在OGDR 24 h组则与对照组差异无统计学意义。OGDR后shRNA星形胶质细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达无统计学意义上变化。结论 Cx43及HCl在星形胶质细胞凋亡过程中起到了促进作用,这可能是IR损伤发生及发展的机制之一。     

缝隙连接蛋白43与创伤后脑水肿相关性研究

目的探讨缝隙连接蛋白43（Cx43）与创伤后脑水肿的相关性。方法大鼠脑损伤前2h经侧脑室注射Cx43特异性阻断剂反义寡核苷酸（ODNs）或生理盐水，用Feeney＇s自由落体法制作局灶性脑损伤动物模型，通过星形胶质细胞的特异性标记物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色，观察脑皮质区星形胶质细胞的形态、数量的变化，同时观察脑组织的水肿情况。结果脑损伤后生理盐水对照组GFAP标记的星形胶质细胞数量较ODNs预处理组明显增多（P〈0．05），细胞胞体较肥大；ODNs预处理组脑水肿较生理盐水对照组明显减轻（P〈0．05）。结论阻断Cx43可减轻脑创伤后脑水肿的程度，Cx43参与了脑损伤后的脑水肿的形成。     

Exendin-4对MCAO再灌注导致的脑缺血/再灌注损伤具有神经保护作用

目的 探讨GLP-1受体激动剂Exendin-4腹腔给药对大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注所致大鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。方法 SD大鼠术前1 h腹腔注射Exendin-4,MCAO再灌注24 h后进行神经功能缺损评分,TTC染色计算脑梗死体积,免疫荧光观察神经元和小胶质细胞生存数量及检测凋亡通路相关蛋白的相对表达水平。结果 Exendin-4能够保护由于MCAO再灌注后所致的脑缺血再灌注损伤,减少了脑梗死体积,降低皮层凋亡蛋白的相对表达水平,抑制神经元凋亡。结论 Exendin-4可以对MCAO再灌注所致脑缺血/再灌注损伤具有神经保护作用,该作用是通过抑制凋亡蛋白的产生,从而抑制细胞凋亡。     

亚低温对星形胶质细胞缺氧后缝隙连接功能的影响

目的观察亚低温对缺氧条件下星形胶质细胞缝隙连接变化的影响,探讨亚低温对脑缺血的保护机制。方法原代培养星形胶质细胞,传至第3代以神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定星形胶质细胞,采用三气培养箱分别调节温度,缺氧12 h。分为正常对照组(对照组)、常温(37.0 oC)缺氧组、亚低温(32.0 oC)缺氧组。用锥虫蓝染色法测定各组缺氧后星形胶质细胞存活率;应用划痕标记染料示踪技术在激光扫描共聚焦显微镜下测定缺氧12 h荧光黄染料在缝隙连接间的扩散距离;细胞免疫荧光技术检验缺氧星形胶质细胞缝隙连接的主要缝隙连接蛋白成分Cx43表达水平。结果常温缺氧组部分细胞边缘皱缩;亚低温缺氧组经亚低温干预后大部分细胞轮廓较清晰,胞周光晕明显,细胞存活力较常温缺氧组增加;对照组、常温缺氧组及亚低温缺氧组死亡细胞数分别为(6.19±0.29)个、(8.54±0.99)个和(6.89±2.41)个,对照组死亡细胞数最少,组间两两比较均差异有统计学意义(P0.05);常温缺氧组荧光黄染料仍可在细胞间进行扩散,扩散距离和Cx43荧光强度较对照组无明显变化(P0.05);亚低温缺氧组与对照组和常温缺氧组比较,荧光染料扩散距离减少、Cx43荧光强度降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论亚低温可以减轻体外培养星形胶质细胞的缺氧损伤;降低Cx43表达而抑制缝隙连接功能,可能是亚低温干预的脑保护机制之一。     

脑白质低灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达变化

目的研究慢性脑白质缺血后星形胶质细胞和缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)的变化。方法原代培养星形胶质细胞,建立体外慢性缺氧模型;双侧颈总动脉狭窄法,建立慢性低灌注脑白质损伤小鼠模型;免疫荧光共染观察星形胶质细胞活化与Cx43表达。Western蛋白定量分析髓鞘相关指标髓鞘相关糖蛋白MAG,星形胶质细胞标记物GFAP和Cx43的表达。结果与对照组相比,细胞慢性缺氧7d后,星形胶质细胞明显增生活化,伴随Cx43表达水平明显上调。Western blot发现,在慢性脑白质缺血过程中,MAG的表达逐渐降低,GFAP持续增高,Cx43表达明显上调。免疫荧光共标记可见,星形胶质细胞中Cx43表达上调,主要分布于胼胝体中央区。结论慢性脑白质缺血损伤过程伴随星形胶质细胞Cx43表达增加,Cx43可能成为临床治疗血管性认知障碍的新靶点。     

缝隙连接蛋白-43阻断剂辛醇对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

目的观察小鼠脑缺血再灌注后缝隙连接蛋白-43(Cx43)表达变化及缝隙蛋白阻断剂辛醇对小鼠梗死体积的影响。方法采用线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO模型),应用免疫印迹(Western blot)方法观察脑缺血再灌注损伤前后Cx43表达变化和辛醇对Cx43表达的影响,并计算各组死亡率及脑梗死体积。结果小鼠脑缺血2h再灌注损伤24h条件下,缺血区Cx43表达在损伤前后无明显变化(P>0.05)。辛醇能显著抑制脑缺血再灌注损伤后Cx43表达,降低死亡率及减少脑梗死体积,具有统计学差异(P<0.05)。结论由Cx43组成的缝隙连接蛋白在脑缺血再灌注损伤过程中具有重要作用,缝隙蛋白-43阻断剂辛醇通过抑制海马及皮质Cx43表达,进而降低死亡率及梗死体积,从而发挥神经保护作用。     

D-阿洛糖治疗脑缺血再灌注损伤后小鼠星形胶质细胞焦亡的影响

目的 研究D-阿洛糖对小鼠脑缺血再灌注损伤(IRI)导致的星形胶质细胞细胞焦亡的保护作用。方法 构建大脑中动脉缺血栓塞模型模拟小鼠脑IRI,经腹腔注射D-阿洛糖治疗(400mg·kg^-1),神经功能评分以及行为学实验检测其大脑损伤情况,苏木精-伊红染色观察大脑组织病理结构改变,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,蛋白印迹检测焦亡相关蛋白消皮素D (GSDMD)和白细胞介素-18 (IL-18)的表达水平,免疫组化与免疫荧光实验检测星形胶质细胞中的焦亡相关蛋白(GSDMD、IL-18)的表达情况。结果 相较于IRI组,经D-阿洛糖治疗后改善了神经功能评分以及行为学表现,减轻了因IRI导致的脑形态学改变,在大脑皮质中焦亡相关蛋白(GSDMD、IL-18)表达降低,并且减少了在星形胶质细胞中焦亡相关蛋白(GSDMD)的表达。结论 在小鼠脑IRI模型中,D-阿洛糖可以减轻星形胶质细胞的焦亡,从而起到保护大脑神经元的作用。     

电针预处理对脑缺血再灌注后SOD_2的表达影响

目的观察电针预处理对脑缺血再灌注后锰超氧化物歧化酶表达的影响。方法成年雄性C57小鼠随机分为假手术组(sham)、电针预处理组(EA)、大脑中动脉栓塞组(MCAO)、电针加大脑中动脉栓塞组(EA+MCAO),采用MCAO法诱导小鼠局灶性脑缺血再灌注模型。再灌2 h应用Western blot以及免疫荧光组织化学染色技术检测SOD2表达,再灌24 h评估神经行为学、测量脑梗死容积和神经细胞凋亡。结果脑缺血再灌注2 h,SOD2表达显著降低,而电针预处理可上调SOD2的表达,增加SOD2在神经元的免疫荧光强度。同时电针预处理可改善缺血再灌注后的神经功能障碍,减轻脑梗死容积率,减少末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞数目。结论电针预处理可上调脑缺血再灌注后SOD2表达,可能参与其诱导的脑保护作用。     

局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑、肝中IGF-1的动态表达及其意义

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑、肝中的表达变化及其意义.方法 采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组化染色方法检测大鼠脑缺血再灌注后2h、1d、3d、7d时脑、肝标本中IGF-1蛋白的含量.结果 正常脑组织有低水平的IGF-1表达,脑缺血再灌注后2h后表达即有明显升高,1d时持续升高,至3d时达高峰,7d时又有所回落,其表达主要位于大脑皮质区.经方差分析,脑组织中IGF-1蛋白含量脑缺血再灌注组与对应各时间点假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05);假手术组各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05);脑缺血再灌注组1d和7d间比较差异无统计学意义(P>0.05),其余脑缺血再灌注组各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05).正常肝组织中有极低水平IGF-1表达,脑缺血再灌注2h、1d、3d后肝组织中IGF-1蛋白含量与假手术组各对应时间点比较差异无统计学意义(p>0.05),脑缺血再灌注7d时与脑缺血再灌注组其余各时间点及假手术组对应时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 脑缺血再灌注损伤后大鼠脑、肝中内源性IGF-1水平有明显变化,提示IGF-1的变化与脑缺血再灌注损伤有关联.     

大鼠脑缺血再灌注损伤后Cx43蛋白的表达模式

目的：建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血再灌注模型,探索再灌注后Cx43蛋白的表达模式。方法75只大鼠随机分为MCAO组（60只）和假手术组（15只）。MCAO组均行MCAO手术,术后根据缺血再灌注时间分为0.5、4、12、24 h 4个亚组,每组15只;假手术组不插入线栓。各组进行改良神经损伤严重程度评分（mNSS）、脑组织TTC染色及神经元尼式染色,Western blot及免疫组织化学方法检测各组脑组织Cx43蛋白的表达并进行统计学分析。结果 MCAO组造模成功率75%。MCAO组大鼠mNSS评分明显高于假手术组（P＜0.05）,脑梗死面积增加,额顶叶皮质区神经元大量损伤。Western blot结果显示：假手术组及MCAO 0.5、4、12、24 h组Cx43表达量分别为0.23±0.12、0.58±0.18、0.78±0.07、0.61±0.05和0.27±0.07, MCAO 0.5、4、12 h组与假手术组差异均有统计学意义（P＜0.05）,而MCAO 24 h组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化结果显示：MCAO组侧脑室下区Cx43的表达在0.5 h开始升高,4 h达高峰,12 h逐渐下降,直至24 h恢复基线水平;与Western blot结果一致。结论 Cx43蛋白在脑缺血性再灌注损伤发生、发展中起重要作用。     

骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的动态影响

目的探讨骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。32只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血骨髓基质细胞移植组和缺血骨髓基质细胞源神经干细胞移植组。分别在移植后7d和14d行脑灌注固定取材,应用免疫组化染色及原位细胞凋亡检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达及凋亡细胞数。结果缺血移植组各时点的凋亡细胞数均少于缺血对照组(P<0.01),缺血移植14d组凋亡细胞数明显少于缺血移植7d组(P<0.01),骨髓基质细胞源神经干细胞移植组凋亡细胞明显少于骨髓基质细胞移植组(P<0.05)。缺血移植组Bcl-2表达显著高于缺血对照组(P<0.01)。缺血移植组Bax蛋白表达明显低于缺血对照组(P<0.01)。结论骨髓基质细胞源神经干细胞可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

肢体缺血预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响

目的探讨肢体缺血预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响。方法将60只Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、肢体缺血预处理组(LIPC组)、3-甲基嘌呤组(3-MA组),每组15只。制作脑缺血再灌注、肢体缺血预处理及3-MA干预大鼠模型,在脑缺血2 h再灌注24 h后进行神经功能缺陷评分和脑梗死体积测定,HE染色观察细胞形态学改变,Western Bloting法检测自噬相关蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表达。结果与I/R组比较,LIPC组神经功能缺陷评分降低(P<0.05),脑梗体积明显减小(P<0.05),细胞损伤、坏死减轻(P<0.05),Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论 LIPC对缺血再灌注损伤大脑具有保护作用,其机制可能与减弱自噬水平有关。     

吗啡预处理与脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡：抑制效应的途径？

[摘要] 背景：大量研究已经证明凋亡是脑缺血再灌注损伤后神经元损伤的重要形式,且这一过程可以人为干预以改善预后。药物预处理对缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响是脑缺血研究的热点。吗啡是临床常用药,几项研究显示其对某种形式的脑损伤有保护作用,但吗啡预处理对脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响尚未见报道。 目的: 探讨吗啡预处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡及相关基因表达的影响。 设计、时间及地点：2008年6月-2009年8月在青岛大学医学院脑血管病研究所完成分子生物学水平的随机对照实验。 材料：神经元凋亡及免疫组化检测试剂盒均由武汉博士德公司提供 方法: 健康雄性成年Wistar大鼠72只,随机分成4组：假手术组;脑缺血/再灌注组;吗啡预处理1mg/kg组;吗啡预处理7mg/kg组,18只/组。依再灌注时间不同,各组又分为再灌注1d、3d、7d 三个亚组,6只/亚组。以Pusinelli方法为标准建立四动脉阻断法全脑缺血模型,假手术组仅暴露第一颈椎双侧翼孔和双侧颈总动脉而不烧灼,不夹闭动脉;脑缺血组缺血前60min腹腔注射生理盐水2mg/kg;吗啡预处理1mg/kg组及吗啡预处理7mg/kg组分别在脑缺血前60min腹腔内注射吗啡1mg/kg及7mg/kg。在脑缺血8分钟后恢复血流,再灌注1d、3d、7d后断头取脑制作石蜡切片。 主要观察指标： HE染色观察海马CA1区组织病理学改变,TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡,免疫组化检测海马CA1区Casepase-3蛋白表达。 结果：HE染色：假手术组海马CA1区神经元结构正常;脑缺血组则出现大量的肿胀、核固缩及胞浆空泡样变异常细胞并神经元数量显著减少;吗啡预处理组细胞肿胀、核皱缩及细胞缺失的病理学改变显著轻于脑缺血再灌注组。凋亡细胞计数：与假手术组比较,缺血组和吗啡预处理组海马CA1区神经元凋亡数明显增加(P<0.01) ;与缺血再灌注组比较, 吗啡预处理组神经元的凋亡数明显减少(P<0.01);与吗啡预处理1mg/kg组比较,吗啡预处理7mg/kg组神经元凋亡数显著降低(P< 0.05 或P< 0.01)。Casepase-3蛋白表达：缺血组和吗啡预处理组Casepase-3表达明显高于假手术组(P<0.01);吗啡预处理组Casepase-3表达显著低于缺血再灌注组(P<0.01);吗啡预处理7mg/kg组Casepase-3表达明显低于吗啡预处理1mg/kg组(P< 0.05 )。应用吗啡后,在1d、3d、7d三个时点,神经元凋亡的减少趋势与Casepase-3降低的趋势一致。 结论： 吗啡预处理可减轻缺血性脑损伤,提高脑缺血耐受性,且大剂量吗啡效果优于小剂量;吗啡抗凋亡作用机制与Casepase-3密切有关。     

γ-氨基丁酸转运体-1与局灶性脑缺血再灌注神经元损伤关系的实验研究

目的探讨γ氨基丁酸转运体1(GAT1)与脑缺血再灌注神经元损伤的关系。方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,分别在脑缺血再灌注3h、6h、12h、24h及3d取损伤侧脑组织进行免疫组化染色,测定标本中GAT1阳性神经元数目和光密度值,并与正常组和假手术组比较。结果脑缺血再灌注3hGAT1表达明显上调(P<0.05),6h达到高峰(P<0.01),12h开始下降,24h后与对照组比较差异无显著性。结论脑缺血再灌注早期GAT1阳性神经元明显增多,其在局灶性脑缺血再灌注中可能参与神经元损伤病理生理过程。     

神经生长因子对兔局灶性脑缺血再灌注神经功能修复的影响和MR影像学评价

目的:研究神经生长因子(NGF)对兔局灶性脑缺血再灌注损伤神经功能修复的影响,并利用MR成像技术进行评价。方法:采用兔大脑中动脉阻断(MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型,分别在缺血2h再灌注损伤后0、1、3和6h应用微量进样器将NGF立体定向导入梗死灶周,于再灌注72h,应用MR影像学、TTC染色和流式细胞术评价兔梗死体积、水肿体积、表观弥散系数(ADC)及神经功能缺损和凋亡状态。结果:缺血再灌注0h、1h、3h和6h灶周给予NGF,梗死体积分别比对照组下降50.1%、48.4%、37.6%和13.7%。同时再灌注3h内应用NGF水肿体积、神经功能缺损评分、灶周凋亡率及caspase-3含量明显下降,梗死中心区及灶周ADC比率(ADCR)升高;再灌注6h后给药,则无明显作用。相关分析显示各组灶周ADCR与灶周凋亡率具有明显负相关。结论:NGF对兔局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用,抑制caspase-3活性的表达和细胞凋亡是其保护机制之一,MR影像学检查可作为定量评价基因疗效的可靠指标。