泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体M26—32的分子生物学特性 …

用泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体Ｍ２６－３２作探针，筛选恶性疟原虫ｃＤＮＡ基因表达文库，结果获得一段含ＮＫＮＤ４个氨基酸靶抗原决定簇表位基因的４７２个碱基的基因序列，用该基因序列作探针与不同种的ＤＮＡ进行杂交，证实该基因序列为一段疟原虫基因序列。在对该基因片段在染色体内的定位分析表明，该基因序列定位于恶性疟原虫的第７对染色体上，且存在于多种不同分离株（包括抗氯喹株）的恶性疟原虫的ＤＮＡ之中，通过Ｇｅ     

单克隆抗体M26—32靶抗原基因片断融合蛋白的表达和特性 …

用温度诱导方法获得了Ｍ２６－３２靶抗原基因片断表达的融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析显示,该融合蛋白能与单克隆抗体Ｍ２６－３２反应,证实了获得的基因序列是单克隆抗体Ｍ２６－３２的靶抗原基因片断。该融合蛋白能与抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫血清反应,且抗该融合蛋白抗体和纯化融合蛋白和抗血清还能与间日疟原虫和恶化疟原虫的疱浆抗原反应,表明该靶抗原基因片断内含有间日疟原虫和恶性疟原虫的共同基因序列,且     

泛种特异性单克隆抗体M26～32的分子生物学特性研究

用含ＮＫＮＤ四个氨基酸序列的特异性ＤＮＡ探针筛选恶性疟原虫ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ基因文库。阳性克隆的插入片段经ＰＣＲ扩增，限制性内切酶消化后重组进Ｍ１３噬菌体并进行序列测定和分析。获得６个阳性克隆，其插入片段４５０ｂｐ～１．３ｋｂ之间。其中６６１克隆的插入片段为４７７个碱基序列，其一端１２０ｂｐ与探针序列一端完全重叠。表明可合并组成一段含启动子、起始密码子和ＮＫＮＤ四个氨基酸的６７８个碱基的单克隆抗体Ｍ２６～３２抗原决定簇基因片段。     

单克隆抗体M26-32靶抗原基因片断融合蛋白的表达和特性分析

用温度诱导方法获得了 M2 6 - 32靶抗原基因片断表达的融合蛋白。 Western- blot分析显示 ,该融合蛋白能与单克隆抗体 M2 6 - 32反应 ,证实了获得的基因序列是单克隆抗体 M2 6 - 32的靶抗原基因片断。该融合蛋白能与抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫血清反应 ,且抗该融合蛋白抗体和纯化融合蛋白的抗血清还能与间日疟原虫和恶性疟原虫的胞浆抗原反应 ,表明该靶抗原基因片断内含有间日疟原虫和恶性疟原虫的共同基因序列 ,且这一共同基因表达的蛋白存在于间日疟原虫和恶性疟原虫抗原之中     

单克隆抗体M26—32腹水有效免疫球蛋白的亚类及等电点的…

单克隆抗体杂交瘤细胞株Ｍ２６－３２的高滴度腹水，用Ｍｏｎｏ Ｑ阴离子交换树脂层析柱进行纯化，并用培养的恶性疟原虫和食蟹猴疟原虫抗原片对纯化后的各管作免疫荧光测定。对纯化后单抗有效成分进行Ｉｇ亚类检测和等电聚焦电泳分析，结果证实Ｍ２６－３２单抗的有效成分为ＩｇＭ，等电点为４．７－４．８５。     

恶性疟原虫云南株丝氨酸重复抗原部分基因的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法特异性扩增ＳＥＲＡ基因片段，并将该基因片段克隆于Ｍ１３噬菌体，用双脱氧链末端终止法进行测序，应用ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析，结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ，Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６∶１，符合恶性疟原虫结构基因的特点。同源性分析显示该基因在不同虫株间高度保守，我国ＰＦＤ－３／ＹＮ虫株ＳＥＲＡ基因片段仅与Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株在第６６７位氨基酸有不同，与ＦＣＲ３（冈比亚）、ＦＣＢＲ（哥化比亚）、及Ｓ１４、Ｓ１５（塞内加尔）等其它虫株ＳＥＲＡ基因序列完全一致。抗原表位预测分析显示该多肽Ｎ端和Ｃ端可能有抗原表位存在。     

恶性疟原虫云南株环子孢子蛋白部分基因的克隆和序列分析

目的：测定我国恶性疟原虫环子孢子蛋白部分基因序列，了解我国虫株与其它虫株CS蛋白基因序列的差异。方法：采用PCR方法特异性扩增CS蛋白基因片段，并将该基因片段克隆于M13噬菌体，取3个阳性克隆制备M13－CSP单链DNA，用双脱氧链末端终止法测定该基因片段核苷酸序列。应用PCGENE软件对六个虫株CS蛋白基因序列进行了一系列比较分析。结果：我国恶性疟原虫云南株（PFD－3／YN）与T4、Welcome、NF54、3D7及7G8等虫株CS蛋白基因序列有不同程度的差异，其中一个有意义核苷酸突变发生在P．fTh／Tc抗原表位区。结论：云南株与其它虫株CS蛋白基因存在差异。     

单克隆抗体 M26～32 腹水有效免疫球蛋白的亚类及等电点的分析

单克隆抗体杂交瘤细胞株Ｍ２６～３２的高滴度腹水，用ＭｏｎｏＱ阴离子交换树脂层析柱进行纯化，并用培养的恶性疟原虫和食蟹猴疟原虫抗原片对纯化后的各管作免疫荧光测定（ＩＦＡ）。对纯化后单抗的有效万分进行Ｉｇ亚类检测和等电聚焦电泳分析，结果证实Ｍ２６～３２单抗的有效成分为ＩｇＭ，等电点（ＰＩ）为４．７～４．８５。     

泛种特异性单克隆抗体M26～32的分子生物学特性研究：I.靶抗…

用含ＮＫＮＤ四个氨基酸序列的特异性ＤＮＡ探针筛选恶性疟原虫ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ基因文库，阳性克隆的插入片段经ＰＣＲ扩增，限制性内切酶消化后重组进Ｍ１３噬菌体并进行序列测定和分析，获得６个阳性克隆，其插入片４５０ｂｐ～１．３ｋｂ之间。其中６６１克隆的插入片段的４７７个碱基序列，其一端１２０ｂｐ与探针序列一端完全重叠，表明可合工组成一段含启动子，起始密码子和ＮＫＮＤ四个氨基酸的６７８个碱基的单克隆抗体     

恶性疟原虫FCC1/HN株新抗原表达序列标记位(ESTs)的获得

目的： 以筛选恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ 株λｇｔ１１ ｃＤＮＡ 表达文库所获得的强阳性克隆作基础, 对上述强阳性克隆的ｃＤＮＡ 插入片段进行ＤＮＡ 序列测定, 阐明相对应的新表达序列标签 （ＥＳＴｓ）, 作为发现新抗原基因的线索。方法：以ｃＤＮＡ 表达文库接头的较长链作ＰＣＲ引物、扩增ｃＤＮＡ 插入片段,将扩增产物克隆入Ｍ１３ ｍ ｐ１８测序载体, 进行部分ＤＮＡ 序列测定、编辑, 将之在ＧｅｎＢａｎｋ 中进行ＤＮＡ 序列同源性搜索比较和分析。结果： 获得１ 个Ｃ０３ 序列为已知恶性疟原虫热休克蛋白７０－２ 基因片段, 发现５ 个新的具有抗原意义的恶性疟原虫表达序列标记位 （ＥＳＴｓ）。结论： 这５ 个新的恶性疟原虫表达序列标记位为发现新的恶性疟原虫抗原基因奠定了基础。     

恶性疟原虫云南株丝氨酸重复抗原部分基因的克隆和序列 …

用ＰＣＲ方法特异性扩增ＳＥＲＡ基因片段，并将该基因片段克隆于Ｍ１３噬菌体，用双脱氧链末端终止法进行测定，应用ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析，结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ，Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６：１，符合恶性疟原虫结构基因的特点。同源性分析显示该基因在不同虫株间高度保守，我国ＰＦＤ－３／ＹＮ虫株ＳＥＲＡ基因片段仅及Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株在第６６７位氨基酸有不同     

恶性疟原虫FCC1／HN株185 kDa和8241kDa保护性抗原的超微结构定位

用LR White树脂低温包埋感染人恶性疟原虫FCC1／HN株的红细胞，用保护性单克隆抗体F6－D3和F6－C2并结合蛋白A－胶体金探针免疫标记恶性疟原虫红内期185kDa和82／41kDa蛋白。结果表明单克隆抗体F6－D3识别的185kDa蛋白定位于游离的和细胞内的裂殖子表面以及未成熟裂殖体的细胞质、质膜及带虫泡膜。而单克隆抗体F6－C2识别的81／41kDa蛋白则定位于未成熟裂殖体及成熟殖子的棒状体中。从超微结构上表明185kDa和82／41kDa保护性抗原分别为恶性疟原虫FCC1／HN株的裂殖子表面抗原和裂殖子棒状体抗原。     

抗恶性疟原虫有性期单克隆抗体的制备和鉴定

以培养的恶性疟原虫ＮＦ５４（３Ｄ７）株配子体蛋白抽提液及我国云南现场采集的恶性疟原虫细胞骨架分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，以ＩＦＡ法筛选出８株抗恶性疟原虫有性期ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株。经免疫球蛋白类别鉴定，６株为ＩｇＧ１（Ｍ２Ａ１０Ｃ９、Ｍ２Ｃ１Ｂ８、Ｍ４Ｃ７Ｂ１０、Ｍ４Ｇ１２Ｃ１、Ｍ５Ｂ７Ｅ６和Ｍ６Ｅ１Ｇ１１），２株为ＩｇＭ（Ｍ４Ｄ７Ｆ７和Ｍ６Ｆ４Ｄ６）。其中３株ＭｃＡｂｓ（Ｍ４Ｃ７Ｂ１０、Ｍ４Ｄ７Ｆ７和Ｍ６Ｅ１Ｇ１１）的靶抗原定位于配子体以及大滋养体和裂殖体期无性体原虫；其余５株仅定位于配子体。经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试验，ＭｃＡｂ所识别的蛋白区带各异（１６－１２０ｋＤ），与已发现的有性期特异性抗原相比较，３２ｋＤ抗原国内外尚未报道。各株ＭｃＡｂ与猴疟（Ｐ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）红内期、鸡疟（Ｐ．ｇａｌｉｎａｃｅｕｍ）子孢子和杜氏利什曼原虫前鞭毛体均无交叉反应。     

聚合酶链反应用于鉴别恶性疟原虫不同分离株的研究

用恶性疟原虫主要裂殖子表面抗原基因序列（ＭＳＡ－１）为引物的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测恶性疟原虫感染。用此方法扩增实验室体外培养的ＦＣＣ１／ＨＮ株恶性疟原虫，显示１条３００ｂｐ的ＤＮＡ片断，而对实验室培养的巴布亚新内内亚ＦＣＱ－２７株则显示１条４４０ｂｐＤＮＡ条带。用此方法检测１５份采自云南缅边界的恶性疟血样均能扩增出ＤＮＡ条带，但不同血样的ＤＮＡ条带的分子量不同，部分血样还存在１条以上的ＤＮ     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序列分析

本研究通过分离、培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取、纯化其基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ｐＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ｐＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ｐＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ，两端分别测定了３２８和２７１个碱基。Ｇ＋Ｃ含量为２６．８％，并有较多的酶切位点，便于作亚克隆，该序列还可用作ＤＮＡ探针或ＰＣＲ扩增模板有较大实用价值。     

应用光敏生物素标记DNA探针监测疟疾的研究

用光敏生物素标记含恶性疟原虫ＤＮＡ片段的质粒ｐＢＥ４探针，通过核酸分了杂交试验，探针的敏感性为２０ｐｇ靶ＤＮＡ和０．００１％原虫血症，并可从多种疟原虫ＤＮＡ标本中特异地检出恶性疟原虫ＤＮＡ，显示该探针具有良好的特异性和敏感性，检测恶性疟病人血样，与镜检的符合率为９５．４％（１２３／１２９）表明探针有良好的应用价值。     

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列,了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段,并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体,用双脱氧链末端终止法进行测序,应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异,３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ,核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。     

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列,了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段,并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体,用双脱氧链末端终止法进行测序,应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异,３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ,核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。     

恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列,为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化;恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养;利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列,其片段大小分别为657bp和1,359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照,无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合,从而,为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。     

恶性疟原虫云南株PFD-3／YN Pfs25基因的测序及同源性分析

目的 了解恶性疟原虫云南株ＰＦＤ－３／ＹＮ ｐｆｓ２５基因序列变异情况。方法 ＰＣＲ扩增恶性疟原虫云南株ＰＦＤ－３／ＹＮ株ｐｆｓ２５全基因，经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序和ＰｓｔＩ酶切鉴定，并与国外恶性疟原虫ＮＦ４株ｐｆｓ２５进行比较。结果 恶性疟原虫云南株ＰＦＤ－３／ＹＮ株ｐｆｓ２５基因与ＮＦ４株的ｐｆｓ２５基因其同源性为９９．２％。结论 ＰＦＤ－３／ＹＮ株与ＦＮ４株ｐｆｓ２５基因表现很高的同