靶向大鼠AT1-R基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠AT1-shRNA腺病毒载体并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-AT1-shRNA真核表达载体中用RT-PCR法扩增出AT1-shRNA片段，将其克隆人PUC18质粒中。酶切构建好的pUC18-AT1-shRNA载体并克隆进入穿梭质粒pDC316中，将构建好的穿梭质粒pDC316AT1-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox△1，3Cre共转染293细胞，包装成重组的病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶、PCR检测和GFP表达证实成功地构建了携带AT1-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带AT1-shRNA片段的重组腺病毒载体，为进一步抗血压研究奠定了基础。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

靶向人血管内皮细胞生长因子-C基因的siRNA腺病毒载体的构建

目的利用AdMax腺病毒系统构建人VEGF-C-siRNA腺病毒载体并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法选择针对人VEGF-C mRNA的特异性siRNA靶序列,设计合成其相应的双链DNA,将其克隆入pDC316-EG-FP-U6载体中构建穿梭质粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,再与骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶、PCR检测和GFP表达证实成功地构建了携带VEGF-C-siRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带VEGF-C-siRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步抗肿瘤淋巴管生成的研究奠定了基础。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点,双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π,酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体,为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。     

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的:利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素(canstatin)重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法:PCR法扩增cansta-tin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAdS-CMV中,获得穿梭质粒pAdS-CMV/canstatin.用PasI酶单独酶切穿梭质粒pad5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7～10 d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果:测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论:成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.     

血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建

目的:构建并制备血管生成素-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因ANG-1,并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack-CMV;使用Padeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组,产生重组腺病毒载体;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果:ANG-1基因与腺病毒穿梭载体连接成功,经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带,证明pAdTrack-CMV-ANG-1重组质粒构建成功;重组的穿梭载体与pAdeasy-1质粒重组后,产物经Pac I酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb,与预期结果相符,证明重组腺病毒pAd-ANG-1-EGFP构建成功;线性化重组的腺病毒转染入QBI-293A细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./L,EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论:成功制备了pAd-ANG-1-EGFP腺病毒. 为骨组织工程血管化的研究打下基础.     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack- PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。     

人Toll样受体2细胞外区基因重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的:克隆人Toll样受体2(TLR2)细胞外区基因,并构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR2. 方法:应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2细胞外区基因,克隆入pUCm-T载体并转化大肠埃希菌感受态DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序分析后,用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,将目的片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,双酶切鉴定并测序验证. 结果:RT-PCR扩增得到约1 000bp的目的基因片段,TA克隆后测序鉴定与GenBank中的序列一致,经酶切连接成功地将目的基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中. 结论:成功克隆了人TLR2细胞外区基因,并构建了含目的基因的重组腺病毒穿梭载体.     

大鼠AQP7基因重组腺病毒载体的构建及其在3T3-L1脂肪细胞中的表达

目的:构建携带大鼠AQP7基因的腺病毒载体,并检测其在3T3-L1脂肪细胞中的表达。方法:采用RT-PCR方法,从大鼠脂肪组织中扩增克隆大鼠AQP7基因,插入到穿梭质粒中获得重组质粒pDC316-AQP7。PCR、酶切鉴定后,重组穿梭质粒和骨架质粒经脂质体2000转染293细胞出毒产生重组腺病毒。经PCR进行鉴定,转染293细胞扩增并纯化,半数组织培养感染剂量(TCID 50)方法测定腺病毒滴度。体外转染分化成熟的3T3-L1细胞,用Western blot方法检测AQP7的表达水平。结果:PCR、酶切及测序证实重组穿梭质粒构建正确。同时成功构建AQP7重组腺病毒,并制备出高滴度的病毒保存液,可以有效转染3T3-L1细胞。结论:成功构建了含大鼠AQP7基因的重组腺病毒载体且其可以在3T3-L1细胞中有效表达,为今后更好地研究AQP7在肥胖发生发展过程中的调控机制奠定了基础。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

人MxA基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。     

TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白的TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体,转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法:设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFα-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果:重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定,证实含有TNFα-Tumstatin融合基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论:成功构建了TNFα-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体,能高效率感染hUCMSCs,为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.