内蒙古地区妇女散发性乳腺癌BRCAl基因突变分析

目的：筛查内蒙古地区散发性乳腺癌患者中BRCAl突变位点。方法：收集新近确诊的乳腺癌患者病例及全血标本40例。以及非癌乳腺良性疾病患者全血30例作为对照,利用TIANampBloodDNA Kit试剂盒获取基因组DNA;PCR方法扩增基因组DNA的BRCAl基因第11外显子的2620～2894bp和3570～3847bp片段．所有标本利用ABl3100-DNA测序仪分析扩增的DNA片段。结果：测序的DNA片段与GeneBank中的序列进行了比对,在所扩增DNA片段中未发现碱基的突变。结论：在我们的研究中所检测的散发性乳腺癌患者的BRCAl基因第11外显子2620～2894bp和3570～3847bp区域未发现突变。     

幽门螺杆菌rdxA基因突变与耐药性关系的研究

目的：探讨幽门螺杆菌（Hp）临床菌株rdxA基因变异与甲硝唑耐药性的关系。方法：从患者胃粘膜活检标本中分离培养Hp。采用纸片扩散法初筛和二倍平皿稀释法确定Hp菌株对甲硝唑的耐药性。提取21株Hp基因组DNA进行PCR扩增，T-A克隆后测序，与文献报道的Hp26695株及134株临床分离株rdxA基因序列进行比较。结果：76.1％（15/21）的Hp菌株对甲硝唑耐药。PCR可扩增出886bp的rdxA基因的片段。与Hp26695株rdxA基因序列比较，扩增产物核苷酸序列的同源性为90.1％-95.1％。甲硝唑耐药菌株rdxA基因出现碱基插入/缺失及碱基替换而引起的突变。结论：rdxA基因突变是Hp对甲硝唑耐药的重要因素。     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变位点的分析

目的 研究上海地区耐利福平结核分支杆菌ropB基因的突变特点,探讨DNA序列分析在药敏测定中的意义。方法 对58株结核分支杆菌rpoB基因片段（约213bp)进行PCR扩增,其中包括核心突变区的69个碱基,并对PCR产物进行DNA测序。其中耐药株36株,敏感株22株。结果 所有58例中,36株耐药株均存在rpoB基因突变,氨基酸突变率531位为47．2％,526位为25．0％,22株敏感株均无突变。结论 rpoB基因核心突变区发生突变是结核分支杆菌对利福平耐药的主要原因,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

PCR直接测序法在脓肿分枝杆菌鉴定中的应用

目的探讨聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S r RNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S r RNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息;针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S r RNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段,但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp;部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息,并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌,并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。     

一种新的HBV DNA rtA181T耐药突变检测方法

目的:通过巢式PCR及特异引物,建立一种新的乙肝病毒(HBV) DNA rtA181T耐药突变的PCR直接扩增检测方法?方法:巢式PCR方法第1轮扩增HBV DNA 逆转录酶rt活性域片段,第2轮PCR上游引物3′末端碱基设计为与HBV DNA rtA181T突变碱基相同的碱基,扩增出的目的基因片段,即为突变片段?利用该方法,本文检测了43例HBV DNA rtA181T变异标本,分析该方法检测的灵敏性;并比较分析低拷贝HBV DNA水平与高拷贝HBV DNA水平下,该方法与PCR-Sanger测序法检测HBV DNA rtA181T突变的一致性?结果:产物经测序证实,突变检测引物巢式PCR法能扩增出HBV DNA rtA181T耐药突变?在HBV DNA水平为24 U/?滋L?rtA181T突变株含量低至10%时,该方法仍能较好检测出rtA181T变异片段?对43例不同拷贝水平的HBV DNA rtA181T耐药变异临床标本检测显示,该方法检测灵敏性达100%,常规PCR-Sanger测序灵敏性为74%,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:基于巢式PCR及突变引物为基础的HBV DNA rtA181T耐药突变PCR直接检测法能较好地检测HBV DNA rtA181T耐药变异发生;对HBV DNA低拷贝水平下的rtA181T耐药变异检测,该方法灵敏性优于Sanger测序法,且有较好的特异性?这对早期发现HBV DNA耐药突变?及时更改抗HBV治疗策略具有重要临床指导意义?     

7个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析

目的：对7个肾上腺脑白质营养不良家系进行基因突变分析。方法：应用RT—PCR技术。对7个患者的ABCD1基因编码区，分4个片段进行扩增并对PCR产物直接测序。应用PCR-限制性酶切或DNA测序等方法分析相应的基因组DNA,进一步确证ABCD1的突变位点。结果：在7名肾上腺脑白质营养不良患者的ABCD1基因上，存在6个不同的碱基置换（709C〉A、807G〉A、1161C〉T、2065C〉T、2113T〉C和2235C〉T）、1个碱基缺失（1801delAG）和1个碱基插入（1126insGCCATCG），分别造成5个错义突变（A141T、R259W、P560L、L576P和R617C）、2个移码突变（fs I246和fs E471）和1个无义突变（S108X）。结论：在中国人肾上腺脑白质营养不良患者中发现4个新的ABCD1基因突变。即S108X、fs I246、R259W和L576P突变。不同家系具有不同的突变位点，且突变类型和表型之间无特殊的相关性。     

骨关节炎关节软骨中软骨细胞线粒体DNA缺失突变的分析

目的：分析骨关节炎病人关节软骨组织中软骨细胞线粒体DNA序列变化,探讨骨关节炎发病的潜在病理机制。方法：应用gap—PCR扩增方法检测10例骨关节炎病人和3例正常关节软骨中软骨细胞线粒体DNA的4977bp缺失突变。采用2轮PCR扩增,第1轮PCR反应以骨关节炎病人的关节软骨中软骨细胞线粒体DNA为模板;第2轮PCR扩增反应以第1轮PCR扩增反应的产物为模板,再次进行扩增。结果：第1轮PCR反应结果显示,mtDNA524bp扩增产物呈阴性,而533bp扩增产物均呈阳性;第2轮PCR扩增反应结果显示,10例骨关节炎病人病例标本中有2例出现524bp区带,而533bp扩增产物均呈阳性。两次扩增,正常关节软骨中软骨细胞和外周血对照524bp扩增产物全部为阴性。结论：骨关节炎病人关节软骨组织中软骨细胞线粒体DNA有8470～13447nt之间4977bp大片段缺失,提示骨关节炎的发病与关节软骨中软骨细胞线粒体DNA的突变关系密切。     

耐利福平结核分支杆菌rp0B基因突变位点的分析

目的研究上海地区耐利福平结核分支杆菌rpoB基因的突变特点,探讨DNA序列分析在药敏测定中的意义.方法对58株结核分支杆菌rpoB基因片段(约213bp)进行PCR扩增,其中包括核心突变区的69个碱基,并对PCR产物进行DNA测序.其中耐药株36株,敏感株22株.结果所有58株中,36株耐药株均存在rpoB基因突变,氨基酸突变率531位为47.2%,526位为25.0%,22株敏感株均无突变.结论rpoB基因核心突变区发生突变是结核分支杆菌对利福平耐药的主要原因,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点.     

用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法：用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物,对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定,并用NC-BI Blast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果：5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出约260 bp的产物,PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100%;2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物,而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物,核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99%,在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论：常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫;从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异,导致与特异性引物结合能力的差异,可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究

目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.     

用聚合酶链反应微孔板杂交技术检测HBV DNA

目的 :建立并优化HBVDNA的PCR 微孔板杂交技术检测体系 ,使临床PCR结果判定更加客观可靠。方法 :采用碱裂解标本中的HBV、玻璃粉吸附提纯模板DNA ,用 5’端标记生物素的引物进行PCR ,PCR扩增产物与包被于微孔板中的靶基因杂交 ,酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合后 ,用酶底物与所标记酶进行显色反应 ,最后通过测定其光密度来判定结果。结果 :建立并优化的PCR 微孔板杂交检测方法提高了检测的灵敏度和特异性。PCR 微孔板杂交法对HBVDNA的检出阳性率 (79.8% )比电泳法 (6 9.0 % )高 ,2 0份非乙肝患者血清标本两方法检测均阴性。结论 :本方法灵敏、特异、操作简便、快速、结果客观可靠。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

人巨细胞病毒UL137基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）UL137基因在先天巨细胞病毒感染临床低传代分离株中的多态性。方法：选择经荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA为阳性的临床分离株进行涵盖UL137全序列的UL136，UL138基因全序列PCR扩增，对扩增阳性的标本进行全序列的测序，核实测序结果，拼接出UL137基因编码序列，进行相关分析。结果：经分析获得22株HCMV临床分离株UL137ORF核苷酸序列，核苷酸变异分布于整个编码区，但主要集中在5’端220—290bp处，均为核苷酸碱基替换，无插入及移码突变。在UL137预测编码蛋白氨基酸序列中，新增2个半胱氨酸位点，导致17株临床分离株在71-76位氨基酸出现了N相连豆蔻酰化位点（MYR）的新增，及第90～92位氨基酸硫化cAMP位点的相应缺失。结论：HCMVUL137基因在临床低传代分离株中高度保守，但存在一定的多态性。     

用聚合酶链反应技术诊断结核病

用聚合酶链反应技术对结核杆菌特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因１２３ｂＰ的片段进行扩增。该法检测人型结核杆菌灵敏度可达到１０ｆｇＤＮＡ，对１４９份结核患者临床标本检测结果显示ＰＣＲ总阳性率（６９．１％）明显高于直接涂片荧光镜检（１５．４％）与细菌培养（１０．１％）的阳性率（Ｐ＜０．０１）。研究表明ＰＣＲ是一种特异、敏感、快速诊断结核病的好方法，值得推广。     

一种简单、稳定、可靠的屏氧酶1基因多态性分析法

目的：建立一种简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。方法：取外周静脉血100μl，用ROSE法提取基因组DNA，用两对引物：P192F 5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′,P192R 5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；P55F 5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′,P55R 5′-TTT AAT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3分别进行PCR扩增，用限制性内切酶AlwI,NlaⅢ对两种PCR产物分别进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的两个PCR产物在192、55多态性位点大小分别为99bp、170bp。Alw I酶切后，凝胶电脉得到完全酶切（66bp,33bp)，部分酶切（99bp、66bp、33bp)，未被酶切（99bp)三种类型DNA片段（RR，QR，QQ基因型）；NlaⅢ酶切后，凝胶电脉得到部分酶切（170bp,126bp,44bp)，未被酶切（170bp)两种类型DNA片段（LM，LL基因型）。经双盲重复检测，结果一致。应用此方法对胃癌患者血样标本检测，发现其PON1基因多态性在192位点频率较高。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。     

应用RT-PCR技术检测啮齿类动物冠状病毒

为了检测啮齿类动物冠状病毒，设计了特异性引物，建立RT—PCR检测方法，并用于检测。在基因文库中查找了啮齿类动物冠状病毒和SARS病毒的基因序列，从N基因片段中，利用计算机软件设计了一对特异性引物，通过确定反应混合物的浓度和反应条件，并建立了一整套从病毒。RNA抽提、反转录到PCR反应的快速检测啮齿类动物冠状病毒的方法，扩增出了148bp的目的片段。并已用于啮齿类动物中检测各组织和拭子中的冠状病毒。该方法对啮齿类动物冠状病毒的早期诊断和与SARS病毒区别有重要意义。     

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。     

真菌通用引物PCR反应鉴别兔眼真菌性和细菌性角膜溃疡

目的 利用真菌通用引物PCR反应，鉴别兔眼真菌性和细菌性角膜溃疡。方法 根据临床上常见的致病细菌菌株(金葡菌、绿脓菌)，真菌菌株(烟曲霉菌、白念菌、镰刀菌)，制作兔眼角膜溃疡的动物模型，选取一对真菌通用引物，一对寡核苷酸引物B2F(5'ACTITCGTAGGATAG-3')和B4R(5'-TGATCGtcttccataaata-3')，对标本进行聚合酶链反应。结果 在687bp处出现DNA扩增带者为阳性。造模后第3d真菌组出现扩增带阳性的90％，第5d真菌组出现扩增带阳性的96．6％。细菌组始终未出现阳性结果。结论 真菌通用引物PCR反应检测鉴别真菌性与细菌性角膜溃疡有较好的敏感性和特异性。