芋螺毒素B179的化学合成及其氧化折叠的研究

目的合成新型芋螺毒素B179,并对其氧化折叠进行研究。方法采用Fmoc固相合成法合成芋螺毒素多肽B179,研究了不同的氧化缓冲液、谷胱甘肽浓度、还原型与氧化型谷胱甘肽的比例、以及温度对氧化折叠的影响。结果采用Fmoc固相合成法可以成功合成线性肽,其氧化折叠产物中主要为含一对二硫键的产物,但还出现了其他副产物,可能是含有分子间二硫键的折叠产物;在高浓度还原型谷胱甘肽环境下,折叠副产物更易形成;随着氧化反应温度升高,折叠反应速率加快。结论固相合成法可以有效合成芋螺毒素B179,且不同因素对其二硫键的形成有着较大的影响,本研究结果可为新型芋螺毒素的合成及其氧化折叠提供借鉴。     

芋螺毒素Tx3h的合成鉴定和活性的研究

目的 芋螺毒素是一类结构多样、数量庞大的海洋药源宝库。研究前期从织锦芋螺毒液中发现的芋螺毒素Tx3h,它的的结构和功能未见报道。方法 通过固相多肽合成法（SPPS）人工合成了Tx3h的线性肽,采用一步氧化法对线性肽进行氧化折叠,获得了Tx3h的两个二硫键连接不同的折叠肽异构体（Tx3h-a和Tx3h-b）,并对其氧化折叠条件进行了优化。通过部分还原及烷基化反应,结合MALDI-TOF-MS/MS分析,鉴定了Tx3h-a和Tx3h-b的二硫键连接方式。采用双电极电压膜片钳技术测试了Tx3h-a和Tx3h-b对α4β2和α3β2 nAChRs的抑制作用。结果 通过氧化折叠条件的优化,Tx3h-a和Tx3h-b的产率分别从7.5 %和9.3 %提高到23.7 %和22.4 %。Tx3h-a和Tx3h-b的二硫键连接方式分别鉴定为I-V, II-VI, III-IV和I-VI, II-IV, III-V。在10 μmol/L终浓度下,Tx3h-a和Tx3h-b对α4β2 nAChR的阻断率分别为(35.06 ± 4.90) %和(34.85 ± 3.02) %,对α3β2 nAChR无阻断作用。结论 通过对芋螺毒素Tx3h折叠肽的合成、二硫键连接鉴定以及乙酰胆碱受体活性检测,发现二硫键连接为I-V, II-VI, III-IV和I-VI, II-IV, III-V的Tx3h折叠肽对α4β2 nAChR有更好的选择性,为其后续研究开发奠定了基础。     

天然芋螺毒素肽的化学合成

芋螺毒素是由热带海洋肉食性软体动物芋螺分泌的、富含二硫键的一类结构多样的小分子多肽。芋螺毒素的化学合成已成为获得毒素肽的主要手段。现总结化学合成芋螺毒素线性肽及其氧化折叠形成二硫键的多种方法 ,并对现阶段化学合成芋螺毒素肽的新进展加以综述。     

作用于乙酰胆碱受体α9α10亚型的芋螺毒素研究进展

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)广泛分布于肌肉、中枢神经系统和外周神经系统中,与各种疾病的发生密切相关。其中, α9α10亚型是近年来发现的新型乙酰胆碱受体家族成员之一,也是全世界生物医学研究者关注的热点之一。研究显示α9α10 nAChR 亚型与人类病理生理状态如慢性疼痛(神经痛)和癌症发展等有关。α-芋螺毒素可以选择性地拮抗神经型或肌肉型 nAChR 的不同亚型。据目前报道,已发现4 种芋螺毒素特异性地作用于α9α10 nAChR 亚型,分别是有α-芋螺毒素RgIA 、 Vc1.1 、 PeIA 和αB-芋螺毒素VxXXIVA 。本文主要对 α9α10 nAChR亚型的药理学功能,以及作用于该亚型的4种α*-芋螺毒素研究进展进行综述。     

α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素,能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关,所以α-芋螺毒素可以开发为研究nAChRs的分子探针或直接作为先导药物进行开发。前期,研究人员从幻芋螺中发现的4种α-3/5型芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,但MIA和MIB对不同亚型的nAChRs阻断活性及选择性还没有深入研究,本研究通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相法合成了α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,并利用电生理技术对它们抑制不同亚型鼠源nAChRs的活性进行系统测定,结果表明MIA和MIB是肌肉型乙酰胆碱受体拮抗剂,半阻断剂量(IC₅₀)分别是14.45和72.78 nmol·L^-1,稍弱于MI与MIC,且对其他神经型nAChRs阻断活性微弱。分子对接研究显示, MIA和MIB与肌肉型nAChRs作用机制类似, N-端氨基酸序列差异是其活性差异的主要原因。本研究表明,芋螺毒素MIA和MIB有潜...     

A-超家族芋螺毒素基因的克隆及其内含子遗传进化分析

目的从中国南海独特芋螺中克隆新的A-超家族芋螺毒素基因,并分析其内含子的遗传进化关系。方法以独特芋螺基因组DNA为模板,根据A-超家族芋螺毒素基因的信号肽保守序列和3’-非翻译区(3’-UTR)保守序列设计特异性引物,通过PCR方法扩增出目的基因片段,并将其连接到pMDTM19-T载体,转化到DH5α感受态细胞并测序,同时对新的A-超家族芋螺毒素基因内含子进行遗传进化分析。结果从海南产独特芋螺基因组DNA中克隆到4条新的完整A-超家族芋螺毒素基因。CaI-M1a,CaI-M1b,CaI-M1c是编码同一种芋螺毒素CaI-M1的3个基因,它们的内含子序列存在较大的差异,特别是其中的GT重复不同。CaXXVII-M2编码产生的成熟肽含有5个半胱氨酸,与传统的属于A-超家族的α-芋螺毒素含有4个半胱氨酸的模式不同。结论首次在独特芋螺中克隆到4个新的含有完整内含子的A-超家族芋螺毒素基因,并表明其内含子的多样性与物种进化和捕食习性有一定的联系。     

α-芋螺毒素特异性结合受体-神经型烟碱乙酰胆碱受体的同源模建及功能预测

目的探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体能被其竞争性拮抗剂α-芋螺毒素选择性阻断的机理。方法采用同源模建的方法构建神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型的三维空间结构,并利用分子对接的方法与已知空间构像的α-芋螺毒素对接。结果已构建的神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型结构合理,并与已知空间构像的α-芋螺毒素对接成功。结论传统的烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂缺乏专一性,而靶向神经元神经型烟碱乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素种类多,特异性强,与不同亚单位组成的受体亲和力不同,应用潜力很大。     

海南产芋螺毒素在疼痛与成瘾治疗中的应用前景

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTX)是热带海洋软体动物芋螺分泌的一类用于麻醉猎物的神经毒素肽,是当今国际生物药物研究的热点,被誉为海洋药物宝库,已跃居动物神经毒素研究的首位。其结构新颖,多样性高,活性强,选择性高,能区分各种离子通道的不同亚型,广泛应用于神经药理学的研究、及作为诊断试剂与治疗药物。不同芋螺种类的毒素互不相同,且同一种类不同个体之间的毒素成份及其活性也差异很大,特别是对神经系统疾病有非常重要的研究与诊断治疗作用。在我国,芋螺是海南特有的药用海洋生物资源,其毒素具有特异结合动物体内各种离子通道受体的特殊功能,在镇痛和戒烟戒毒,以及治疗帕金森症、精神病等重大疾病方面具有极好的应用前景。芋螺毒素大多是由7～50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸(Cys)的神经肽毒素。芋螺毒素按其前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性,以及半胱氨酸模式,分为不同的基因家族,至今,所有已知的芋螺毒素可分为17个超家族,分别为A,C,D,S,M,I1,I2,I3,J,L,O1,O2,O3,P,T,V,Y。按其受体靶位可分为α,ω,μ,δ等多种药理学家族。每个超家族根据受体靶类型,又可分为α,αA,κA(A-超家族),ω,δ,κ,μO(O-超家族),μ,ψ,κM(M-超家族)等家族(亚型)。其中的α-家族类芋螺毒素(α*-CTX)特异阻断哺乳动物的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs是动物界普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的离子通道型受体,其介导众多中枢和外周神经系统的生理功能,包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点,这些疾病包括成瘾、疼痛、癌症、智障、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChRs激动剂如烟碱,虽然可以缓解上述神经疾病的症状,但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用,且有成瘾性。因此,开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。研究表明,α9α10 nAChR是治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合等的新靶点;阻断脊髓神经上的α3β2nAChR,通过抑制C-纤维释放谷氨酸进行疼痛信号的传递,可产生镇痛效应。α9α10 nAChR阻断剂具有治疗神经痛和加速受伤神经恢复的功能。角化细胞上的α9α10 nAChR在伤口愈合的病理生理学过程中起着很重要的作用。α9nAChR亚基在乳腺癌组织中过表达。α9亚基变体影响支气管细胞的转化与增殖,该亚基在乳腺癌与肺癌的治疗中具有非常重要的意义。表达在多巴胺能神经元上的α6β2*-nAChRs能被内源乙酰胆碱(Ach)或外源烟碱(尼古丁)及其类似物激活,也就是说,α6β2*-nAChRs的激活在中枢神经系统的胆碱能信息传递通路中起着至关重要的作用,包括运动行为以及药物成瘾的调节。阻断含有α6β2*的nAChRs可有效防止烟瘾、可卡因和吗啡毒瘾的发作,显著抑制吸烟和吸毒的欲望,预示α-芋螺毒素在戒烟、戒毒新药的研发领域具有巨大的潜力。能治疗成瘾的α-芋螺毒素的预期经济和社会效益无可限量。已证实α6/α3β2β3 nAChR是烟碱和其他药物,如可卡因和吗啡等成瘾治疗的新靶点。另外,阻断α3β4 nAChRs可有效减少鸦片与其他刺激物的自身给药欲望和行为。α3β4 nAChR基因敲除的小鼠明显减少烟瘾的发作。因此,α6/α3β2β3与α3β4 nAChRs阻断剂在戒烟戒毒新药的研发领域具有非常重要的价值。我们从海南产芋螺中研究发现了5个特异阻断nAChRs的新颖芋螺毒素及其突变体,分别是αB-CTX VxⅩⅩⅢA,αO-CTX GeⅩⅣA,3个α-CTXs LvⅠA,Txd4和TxIC突变体。其中,αB-CTX VxⅩⅩⅢA来自菖蒲芋螺(Conus vexil-lum),是我们首次发现的一个新超家族芋螺毒素,其半胱氨酸模式和信号肽、以及前肽的组成区域均与以往发现的芋螺毒素完全不同,我们将之定名为B-超家族芋螺毒素,第23种(ⅩⅩⅢ)半胱氨酸模式(4个Cys)的第一个毒素肽。含有40个氨基酸的αB-CTX VxⅩⅩⅢA的前体肽只含有信号肽和成熟肽,而没有其他已知超家族普遍含有的前肽区部分。我们成功合成了αB-CTX VxⅩⅩⅢA的3种可能的异构体,经活性检测发现,αB-CTX VxⅩⅩⅢA是α9α10 nAChR的特异阻断剂。来自将军芋螺(C.generalis)的新芋螺毒素αO-CTX GeⅪⅤA,与O-超家族芋螺毒素前体蛋白信号肽具有很高的同源性,αO-CTX GeⅪⅤA前体由信号肽、前肽和成熟肽3部分组成,推导的含有28个氨基酸的成熟肽含有与J-超家族芋螺毒素相同的半胱氨酸模式。高浓度的αO-CTX GeⅪⅤA既是nAChRs的阻断剂,也是NMDA受体〔N-methyl-D-aspar-tic acid receptor(NMDAR)〕的阻断剂,低浓度的αO-CTX GeⅪⅤA对α9α10 nAChR具有很好的选择性和最强的生物活性,其半阻断剂量(IC50)仅为4.6 nmol·L-1。系统研究了αO-CTX GeⅪⅤA对18个α9α10 nAChR与配体结合界面的关键氨基酸突变型的阻断活性,以及确定结合部位的竞争性试验。3个新的α-芋螺毒素(α-CTX)属于A-超家族芋螺毒素成员,分别是来自疣缟芋螺(Conus lividus)的LvIA,来自织锦芋螺(C.textile)的Txd4与TxIC突变体。它们对相应的nAChRs亚型具有极好的选择性和很强的生物活性。α-CTXLvIA特异阻断α3β4 nAChR,其半阻断剂量(IC50)为12.5nmol·L-1;α-CTX Txd4特异阻断α6/α3β2β3 nAChR,其半阻断剂量(IC50)为28 nmol·L-1;α-CTX TxIC突变体特异阻断α3β2 nAChR,其半阻断剂量为14.5 nmol·L-1。这些新的海南产α-家族类芋螺毒素的作用靶点清楚,活性强,选择性高,是开发镇痛和戒烟戒毒等新药的原创先导药物,蕴涵着巨大的经济价值和社会效益。     

作用于烟碱乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素研究进展

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTX)是从热带海洋软体动物芋螺中得到的一类具有生物活性的多肽毒素,能特异性地作用于动物体内各种离子通道及受体,已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注。芋螺毒素包括O-,M-,A-,S-,T-,P-,I-,等多个超家族,其中A超家族的α-芋螺毒素是芋螺毒素家族中的一类重要成员,能特异地作用于乙酰胆碱受体(nAChRs)各种亚型,对疼痛、成瘾、抑郁症、帕金森氏病、肌肉松弛等具有潜在的药用价值。因此,对α-芋螺毒素进行深入系统地研究具有极其重要的意义。本文就作用于nAChRs的α-芋螺毒素的研究现状进行综述。     

α-芋螺毒素TxIB氧化折叠路径研究

目的：阐明TxIB线性肽通过一部氧化法,在体外被氧化折叠形成含有两对二硫键活性肽的具体路径,为后续大量人工合成该活性肽的方法研究提供基础。方法 采用N-9芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成法人工合成TxIB线性肽,用高效液相和质谱分析法,监测研究TxIB一步氧化折叠过程中所经历的路径。结果 TxIB氧化路径经历了1对二硫键（1SS）、2对二硫键（X-2SS）折叠中间体后,最终形成稳定的含有2对二硫键（N-2SS）的氧化型TxIB。结论芋螺毒素TxIB折叠路径与前期研究的水蛭素氧化折叠路径一致。     

α-芋螺毒素TxIB抗药物依赖的初步探索

目的 探究作用于α6/α3β2β3烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)的α-芋螺毒素TxIB对吗啡/尼古丁诱导条件性位置偏爱(CPP)的影响,为进一步设计筛选抗药物依赖的芋螺毒素提供理论和实验依据。方法 选用SPF级雄性C57BL/6小鼠,采用皮下注射吗啡(5 mg/kg)或尼古丁(0.5 mg/kg)建立CPP模型。侧脑室注射不同剂量的α-芋螺毒素TxIB,记录小鼠在伴药箱的停留时间。结果 皮下注射吗啡(5 mg/kg)或尼古丁(0.5 mg/kg)均可成功建立CPP模型,经侧脑室注射不同剂量的TxIB后测值,发现TxIB能显著性抑制吗啡/尼古丁诱导小鼠CPP的表达(P<0.05),且存在剂量依赖性效果。侧脑室注射最高剂量TxIB(10 nmol)对生理盐水对照组小鼠在伴药箱停留时间无影响(P>0.05)。结论 α-芋螺毒素TxIB可以抑制吗啡/尼古丁诱导小鼠CPP的表达,有望进一步开发成为戒烟戒毒的候选新药。     

靶向神经元nAChRs的α-芋螺毒素

传统的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)拮抗剂缺乏专一性,而靶向神经元nAChRs的α-芋螺毒素种类多,特异性强,与不同亚单位组成的受体亲和力不同,应用潜力极大。为了更好地研究nAChRs亚型和有效治疗神经性疾病,此文对RgIA、Lp1.1、BuIA、PIA、OmIA、Vc1.1(ACV1)等6种靶向神经元nAChRs的α-芋螺毒素进行了综述。     

芋螺毒素研究进展

芋螺毒素是含约１０－３０个氨基酸残基的小肽，大多富含二硫键，可分为α－，μ，ω－，δ－，芋螺睡眠肽，加压素，惊厥剂等。已确定四十余个毒素的序列，对４个有代表性的芋螺肽进行了溶液构象分析和构效关系的研究。本文介绍了芋螺毒素研究历史。综述了国外对甚至芋螺毒素的构效关系研究的结果及应用研究情况。     

广谱解毒剂—还原型谷胱甘肽

谷胱甘肽(L-Glutathione,Gluthione-SH,GSH)是一种广泛分布的三肽类化合物,临床用其还原型,故亦称还原型谷胱甘肽(Atomolan)。虽然它的存在早就为人们所了解,但对其广泛研究还是近年来的事。 Atomolan内具有活性巯基,能参于细胞内的氧化还原反应。当它被氧化时,二分子还原型谷胱甘肽结合成一分子氧化型谷胱甘肽, 所以在正常情况下,GSH能将体内形成的氧化物(如正常代谢过程中不断产生的过氧化     

芋螺毒素的环化研究

芋螺毒素生物活性强,对药物作用靶点的选择性高,在治疗神经性疼痛等疾病方面具有很好的开发前景。然而天然芋螺毒素容易受到体内蛋白酶的水解。将其进行环化,可增加它们在人体内的稳定性,从而具有口服活性。本文以α-芋螺毒素Vc1.1和MII环化后的稳定性与活性变化、环化的合成方法为例,对芋螺毒素的环化研究进展进行综述,说明环化的芋螺毒素将有可能在治疗神经性疼痛等疾病中扮演一个重要的角色。     

海南产大尉芋螺的新型O-超家族芋螺毒素基因克

目的从海南产大尉芋螺毒液中分离克隆新型O-超家族芋螺毒素基因,为大尉芋螺毒素药物的研究与开发提供源头化合物。方法采用快速扩增cDNA 3’-末端（3’-RACE,Rapid Amplification of cDNA Ends）的方法,对我国海南产大尉芋螺（Conus capitaneus Linnaeus）的毒素cDNA进行分析,克隆测序所得基因片段,再进行序列比较,以及O-超家族芋螺毒素基因的遗传变异分析。结果发现了1种新的O-超家族芋螺毒素cDNA序列CaHr91N,编码长度为77个氨基酸（aa）的前体蛋白CaHr91P,具有典型的芋螺毒素前体结构特征,即由21aa的信号肽、22aa的前肽与34aa的成熟肽三部分组成。毒素区的成熟肽CaHr91M序列为ECREQSQGCTNTsPPccsGLRCSGQSQGGVCISN,具有O-超家族芋螺毒素保守的半胱氨酸框架C-C-CC-C-C．同时比较分析了CaHr91P与其它同源性的O-超家族芋螺毒素的相似性,以及大尉芋螺毒素的研究状况。结论CaHr91P新芋螺毒素基因的发现,及其序列的阐明,为进一步研究其生物活性和应用奠定了基础,同时为更多大尉芋螺毒素的发现和研究利用积累了经验。     

作用于电压门控钠离子通道的芋螺毒素研究进展

电压门控钠离子(Na+)通道(VGSCs)对兴奋细胞动作电位具有调节作用,许多生物毒素能与VGSCs相互作用。近年来研究发现,热带海洋肉食性软体动物芋螺中含有多种多肽类毒素(芋螺毒素或芋螺肽),其中一大类芋螺毒素能与Na+通道各种亚型特异结合,改变Na+通道的功能,对于研究Na+通道的结构和功能以及研发作用于Na+通道的相关药物或其先导化合物具有重要作用。本文就近年来发现的作用于Na+通道的芋螺毒素的研究进展进行综述。     

中国南海织锦芋螺毒素的分离及鉴定

目的从中国南海织锦芋螺中分离新的芋螺毒素,为药物发现、药物设计提供新的活性多肽或前体多肽,比较不同地域织锦芋螺毒素的构成,研究环境对织锦芋螺毒素分泌的影响。方法织锦芋螺毒液经预处理后,凝胶层析分离粗毒,用HPLC进一步分离,氨基酸测序。结果分离得到了10余个织锦芋螺毒素组分,确定了10个织锦芋螺毒素的氨基酸序列,其中4个为新型织锦芋螺毒素,6个与已报道的相同。结论中国南海织锦芋螺毒液中含有丰富的M族芋螺毒素,毒素成分与菲律宾宿务岛(Cebu)、马尼拉岛的织锦芋螺相似。     

5种南海产芋螺粗毒组分对α3β2和α4β2乙酰胆碱受体阻断活性研究

目的 为南海产丰富的芋螺生物资源的深入挖掘和开发利用,为从毒液中发现和寻找新型活性强、选择性好的阻断α4β2 nAChR的芋螺毒素奠定基础。方法 通过对五种南海常见芋螺(豹芋螺、黑芋螺、玉女芋螺、信号芋螺、和帝王芋螺)的毒液进行提取、分段,并采用双电极电压膜片钳技术测定了五种毒液各个组分对α4β2 nAChR和α3β2 nAChR的阻断活性。结果 豹芋螺、黑芋螺、信号芋螺和帝王芋螺这四种芋螺毒液的部分组分表现出较好的α4β2 nAChR阻断活性,同时也对α3β2 nAChR具有一定的阻断作用。豹芋螺大部分组分和黑芋螺毒液Mar-2组分对α4β2 nAChR有明显的阻断作用,阻断率分别高达40 %以上和73.6%,且这些组分未对α3β2 nAChR表现出阻断作用或作用很弱,即对α4β2 nAChR有良好活性且相比于α3β2 nAChR对α4β2 nAChR有较好的选择性。结论 本研究结果为后续对豹芋螺粗毒组分进行活性跟踪的分离纯化,为获得豹芋螺来源的新型芋螺毒素并阐明其结构和功能提供理论依据,为后续寻找选择性阻断α4β2 nAChR的新型芋螺毒素指明了研究方向,为深入开发利用南海产芋螺生物资源奠定了坚实基础。     

疣缟芋螺毒素的二维液相色谱分离方法

目的建立一种新的基于二维液相色谱技术的疣缟芋螺毒素分离方法,了解其毒素组构成特点。方法从疣缟芋螺毒管中提取芋螺毒素总肽,在传统的凝胶色谱和反相色谱方法的基础上,根据芋螺毒素的等电点和疏水性,利用目标蛋白快速分离系统(Proteome Lab TMPF2D),对其进行二维分离。结果经过传统分离方法,能够检测得到40个左右的芋螺毒素条带,且分离效果不明显。而通过二维液相色谱分离方法,pI/UV图谱显示共检测到约200个芋螺毒素条带。结论同传统分离方法相比,采用Proteome LabTMPF2D系统对毒素分离更快速、分辨率更高,因此更利于鉴定芋螺毒素肽组分,也为下游序列结构特征与生物活性研究奠定了良好的基础。