登革1型病毒GZ2002株全基因组测序与分析

目的对2002年分离自广州登革热患者的1型登革病毒GZ2002株进行全基因组序列测定及分析,为探讨其来源和基因组特征提供依据。方法利用C6/36细胞增殖GZ2002株,出现典型细胞病变后收集感染细胞及病毒液提取R NA。根据5株登革病毒1型标准株AY145123、FJ176780、FJ176779、DVU88536、EF025110全序列设计6对相互覆盖的引物。采用R T-PCR法扩增覆盖GZ2002株基因组全长的6个cDNA片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体上,通过序列测定和重叠序列拼接获得全基因组序列。结果 GZ2002株基因组全长10 735 nt,单一阅读框长10 176 nt,推测编码3 392个氨基酸,5’及3’-UTR分别为94 nt和462 nt,无显著的密码子偏嗜性。GenBank登录号:JN205310。系统进化分析显示GZ2002株属于DENV-1型基因IV型。比较不同致病性的DENV-1型毒株发现,随DENV毒株致病力的增强,编码区氨基酸突变位点明显增多。GZ2002株、泰国16007株、柬埔寨株及印度尼西亚98901530株的5’-UTR二级结构高度保守,3’-UTR分析显示强毒力泰国16007株与柬埔寨株均存在高突变区。结论 GZ2002株属于DENV-1型基因IV型,可能与1998年印度尼西亚DENV-1流行株相关,编码区株特有氨基酸变异位点及3’-UTR高突变区的生物学意义值得进一步探讨。     

两株盖塔病毒全基因组序列测定与分子遗传进化

目的 对2011年和2017年分别在我国甘肃省和海南省分离的两株盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）进行全基因组核苷酸序列测定,分析其与我国1964年首次分离的盖塔病毒（M1）的分子差异及分子遗传进化特征。方法 使用病毒基因扩增技术测定新分离的两株盖塔病毒全基因组核苷酸序列,建立盖塔病毒基因组数据集并使用生物信息学软件进行病毒分子特征及分子遗传进化分析等。结果 两株新分离盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）基因组全长分别为11 690 nt和11 621 nt。两株病毒均具有甲病毒基因组结构特征。虽然两株病毒的结构基因、非结构基因以及非编码的连接区核苷酸序列长度均完全相同,但是病毒基因组5’和3’非编码区的核苷酸序列长度存在差异。两病毒株基因组3’UTR重复序列单元的结构未发生变化。病毒基因组同源性分析结果显示,海南省2017年分离的盖塔病毒（HNDZ1712-1）与我国于1964年首次在海南省蚊虫分离的盖塔病毒（M1）之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为97.7%和98.1%。盖塔病毒全基因组核苷酸序列的分子遗传进化分析结果显示,本研究的两株病毒及其所属病毒株...     

深圳市登革1型病毒株全基因组特征及系统进化分析

目的对深圳市2014年登革病毒1型(DENV-1)流行株进行全基因序列测定,分析其分子病毒学特征,探讨其可能来源。方法采集2例登革热患者急性期血清标本,用BHK-21细胞培养分离病毒,RT-PCR进行病毒血清型别鉴定,并用RT-PCR进一步扩增全基因组序列,测序后进行同源性比较、系统进化树分析和遗传变异分析。结果 2例深圳DENV-1分离株进行全基因组测序结果显示同源性为100.0%,其基因组全长均为10 735 bp,编码3 329个氨基酸,与新加坡DENV-1流行株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为99.3%和99.7%。全基因组序列系统进化分析显示,深圳DENV-1株为基因Ⅰ型,与Fujian2004、Zhuhai2007和Singpore2008的亲缘关系较近,均在同一进化分支上。与广州DENV-1株GZ/80相比,深圳2014年DENV-1分离株发生了碱基变异430个,氨基酸变异42个,5’UTR存在1处点突变,3’UTR序列共有8处位点发生变异。结论 2014年深圳市DENV-1株可能来源于东南亚一带。病毒在进化过程中出现一些位点变异,这些变异的生物学意义有待进一步研究。     

广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析

目的从2002年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒,明确流行株的血清型及基因型,并鉴定该分离株的毒力。方法采集疑似登革热患者血清20份,应用C6／36细胞体外培养的方法进行病毒分离,并合成登革病毒通用引物,进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)后,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对。确定血清型后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E／NS1连接区基因片段,测序后用邻位相连(N—J)法构建登革病毒进化树,分析此次登革病毒流行株的来源。通过乳鼠脑内接种及空斑实验,测定分离株的毒力。结果上述20份血清标本中,5份标本出现明显的细胞病变,主要表现为细胞融合,形成大小不一的空泡和网状结构。RT-PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型。E／NS1连接区基因序列片段分析表明,2002年广州分离株(DEN-1／GZ2002)的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN—1／T14株(澳大利亚,1981)同源性最高,达98％。N—J法构建进化树显示：11株DEN-1病毒分成3个基因群,分别与Rico-Hesse1990分型中的Ⅰ,Ⅳ和Ⅴ型以及Ana P．Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美N／tbN型相符,本室分离的DEN-1／GZ2002株属于Ⅳ型或者称南太平洋型。DEN-1／GZ2002株脑内接种乳鼠11d左右导致乳鼠弓背,后肢麻痹、瘫痪,直至死亡。感染Vero细胞8d后可见小而不透明的空斑,病毒滴度可达10^6pfu／ml,TCID50为4．37log pfu／0．2ml。结论2002年广州登革热流行为登革病毒Ⅰ型感染所致,病毒基因型为Ⅳ型,本实验虽然未明确毒力相关基因,动物实验及细胞感染实验证实该分离株的毒力较弱。     

肠道病毒71型基因组5'非编码区序列分析

目的 了解2009年山东省临沂市分离的肠道病毒71型(EV71)基因组5 '非编码区(5'UTR)序列特征,探讨基因组中引起神经毒性作用的候选位点.方法 从手足口病患者的粪便标本中分离EV71,运用一步法逆转录聚合酶链反应扩增8个病毒株的5 'UTR区,运用DNAstar和MEGA 4软件进行序列分析.结果 8个病毒株5'UTR区核苷酸为741 ～745 nt,核苷酸序列同源性介于97.0％～99.9％,8个病毒株的5'UTR区与C4亚型的同源性最高.序列比对发现,在5'UTR区第265 nt及703 nt处出现了核苷酸的突变(G265A,G703T).遗传进化分析显示,8个病毒株序列与C4亚型的亲缘关系最为密切.结论 此8个病毒株为C4亚型,核苷酸突变(G265A,G703T)可能与EV71的致神经毒性作用有关.     

河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析

目的:了解2010年河南省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征.方法:筛选2010年河南省分离的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010),进行全基因组序列测定和基因进化特性分析.结果:EV71/Henan/DC/2010与其他EV71病毒株相比,编码区无核苷酸的缺失或插入,5'UTR区和3'UTR区...     

广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株E基因序列分析

目的测定广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株的E基因序列并进行分析。方法收集广州市2006年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发生树,进行生物信息学分析。结果59份标本中38份病毒分离培养阳性,获得广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2006/1707的E基因序列,其同源性与东南亚缅甸、泰国、柬埔寨等地的流行株接近,但与广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2002/281较远。结论广州市2006年流行的登革病毒属输入性,但与2002年流行的登革病毒有不同的输入源。     

肠道病毒71型山东分离株全基因组序列分析

目的 探讨2008年山东省流行的肠道病毒71型(EV71)的基因特征。方法 以2008年山东省分离的一株EV71(JN200804)为样本,采用RT-PCR方法扩增并测定全基因组核苷酸序列,进行同源性比较和种系发生分析。结果 JN200804株的全基因组序列长度为7404个核苷酸,与其他EV71毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,5′ UTR和3′ UTR的长度和序列有差异。核苷酸同源性比较结果表明,JN200804株与安徽株(Fuyang/17.08/1)、浙江株(Zhejiang08)和北京株(BJ08)的核苷酸同源性均大于95%,与国际标准株BrCr的同源性仅为79.8%。氨基酸同源性比较结果表明,JN200804株与Fuyang/17.08/1同源性高达99.6%,与TW/2086/98同源性最低(94.5%)。根据P1、P2和P3区基因序列构建了种系进化树: JN200804株与C4亚型各毒株(Fuyang/17.08/1、Zhejiang08、BJ08、SHZH03、N3340-TW-02和SHZH98)同属一个分支,核苷酸同源性都在91%以上。结论 JN200804株属于EV71的C4亚型,与AnhuiFY08、Zhejiang08和BJ08的进化关系最为密切。     

佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

Molecular epidemiology of dengue in Jamaica dengue virus genotypes in Jamaica, 2007

The genotypes of dengue viruses (DENV) isolated from patients with dengue in Jamaica during 2007 were determined using DNA sequencing and phylogenetic analysis of the C-prM gene junction. The 17 DENV analysed included strains of DENVserotypes 1 (DENV-1, n = 3), DENV-2 (n = 7) and DENV-4 (n = 7). All strains ofDENV-1 were classified as genotype III, while 1 of 7 strains of DENV-2 belonged to the Asian American/Asian genotype, genotype I/III (Jamaica genotype), 2 were genotype V, the American genotype and 4 strains clustered with reference strains belonging to genotype IV. The 6 DENV-4 strains from Jamaica and the control strain clustered together in a separate clade from Caribbean/American reference strains, which belong to genotype II and Asian strains, classified as genotypes I and III. There has been little evolution in the DENV-1 strains circulating in Jamaica over the years and this might reduce the risk of outbreaks due to this serotype. In contrast, the high genetic diversity in strains of DENV-2 viruses in circulation, the presence of more recently introduced genotypes and a new clade of DENV-4 might contribute to the epidemic potential of these DENV serotypes. These preliminary data clearly indicate the need to maintain laboratory surveillance, and other control measures against hyperendemicity of dengue in Jamaica.     

广州登革病毒1型NS2a-NS2b基因序列分析

目的对2004年广州军区总医院收治的1例疑似登革病毒感染者进行确诊,通过对病毒的基因序列分析。寻找该例感染病毒的可能来源。方法首先从疑似病人的血清提取血液RNA,用RT—PCR法对比较保守的病毒非结构蛋白NS2a-NS2b上的部分序列进行扩增,并进行基因克隆、测序及同源性分析。结果经RT-PCR和基因测序检测证实为DEN1感染;基因序列分析结果表明．该病毒与我室保存的1995年、1997年、1999年和2003年的DEN1流行株非结构蛋白NS2a-NS2b的部分序列同源性分别为90．8％、97．6％、100％和99．6％。结论该例疑似登革病毒感染患者被确诊为DEN1型病毒感染。与1999年广东省中山市的登革1型病毒流行株在部分非结构蛋白NS2a-NS2b上完全相同．并与1997年广东省潮州市和2003年广州市的流行株为同一基因型。由此初步推断,在我国可能已存在登革1型病毒的疫源地。     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

Molecular Characterization of Full-length Genome of Japanese Encephalitis Virus Genotype V Isolated from Tibet,China

Objective To determine the molecular characterization of full-length genome of Japanese encephalitis virus （JEV） genotype V. Methods The full-length nucleotide sequences of JEV strains isolated from different locations and sources were used in sequence and phylogenetic analysis. Results The full-length genome of genotypes V JEV, XZ0934, and Muar strain were composed of 10 983 and 10 988 nucleotides respectively and shared a lower level of identity with JEV genotypes I-IV, ranging from 78.4% （G I, KV1899） to 79.7% （G III, JaGAr01）, for the nucleotide sequences, and from 90.0%（G I, KV1899） to 91.8%（G III, JaGAr01） for the amino acid sequences. The open reading frame （ORF） of JEV genotype V spanned nucleotides 96 to 10 397 and encoded 3 433 amino acids. Interestingly, a comparison with JEV genotype I-IV revealed that 3 nucleotides （encoded with a serine residue） were inserted in the NS4A gene of JEV genotype V, and the insertion of nucleotides was also found in downstream of the ORF stop codon in 3’-untranslated region. Moreover, numerous amino acid mutations were observed in 3 functional domains of the E gene of JEV genotype V. Conclusion The molecular characterization of JEV genotype V is significantly different from that of the known genotypes I-IV. The mutations located in the coding region and the non-coding region may be molecular markers of JEV genotype V and warrant further studies to determine their effects on biology and immunogenicity of genotype V strains.     

河南省1例柬埔寨输入登革热病例的病原分子分型与全基因序列分析

目的鉴定河南省1例来自柬埔寨的登革热输入性病例的登革病毒(dengue virus,DENV)血清型和基因型及其序列特征和传播来源。方法患者血液标本来源于2019年国家疾病监测系统网络直报的登革热疑似病例。样品经快速检测DENV NS1抗原和IgM/IgG抗体,再提取血清中核酸,应用荧光RT-PCR法进行DENV血清型鉴定,同时用Vero和BHK-21细胞对血清标本进行病毒分离培养,阳性培养物扩增全基因组序列,进行序列系统进化分析。结果该病例实验室确诊为DENV 1型感染,并从血清标本中分离到病毒株,测序后拼接成全长10670 nt的全基因组序列,经系统进化分析,该病毒株属于DENV 1型基因Ⅰ型,与东南亚流行株具有较高同源性和较近亲缘关系。结论2019年河南省来自柬埔寨的输入性病例的病原体为DENV 1型基因I型,此为近年来东南亚输入我国的常见血清型和基因型。     

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响

目的：研究登革2型病毒（DENV-2）、登革2型病毒国际参考株（NGC）E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株（M）E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性的影响.方法：将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果：DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论：DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的 通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DV1)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析,了解各流行株之间的遗传差异,追踪其可能的传染来源。方法 应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因,克隆到PMD18-T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定,应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析,并绘制基因系统发生树。结果 3株DV1病毒E基因序列长度均为1485bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性在91%~98%之间,推测的氨基酸序列同源性在94%~99%之间。GD23/95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95%(98%),与其他株的同源性相对较低,2株属同一基因型;GD14/97和GD05/99与Cambodia共享序列非常接近,3株同属另一基因型。结论 广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。