难治性颞叶癫癎患者脑内KCNJ4基因表达的研究

目的观察内向整流钾离子通道亚单位基因KCNJ4 mRNA及其编码的蛋白产物Kir2.3在难治性颞叶癫癎患者和急性脑外伤患者脑内的表达差异,从分子水平探讨难治性颞叶癫癎可能的发病机制.方法 12例难治性颞叶癫癎患者手术切除的颞叶组织,10例急性脑外伤患者相应部位颞叶组织,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与蛋白印迹检测(Western-blot)方法检测两组间KCNJ4 mRNA(KCNJ4 mRNA/β-actin)与Kir2.3通道蛋白(Kir2.3/β-actin)的表达.结果难治性颞叶癫癎患者与脑外伤患者比较,颞叶组织KCNJ4 mRNA(0.438±0.178)及Kir2.3通道蛋白(0.063)的表达水平均降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 KCNJ4 mRNA表达水平的下调及其编码产物Kir2.3通道蛋白表达水平的下降,可能是难治性颞叶癫癎发生发展的重要的分子学基础之一.     

颞叶癫大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化

目的 研究颞叶癫(癎)大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化.方法 给SD大鼠腹腔注射匹罗卡品、氯化锂制作颞叶癫(癎)模型.用免疫组化法和原位杂交技术对致(癎)后不同时间点大鼠海马CA1区、CA3区、齿状回的Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白表达进行检测,并与正常对照组比较.结果 颞叶癫(癎)大鼠致(癎)后7 d、15 d,海马CA1区、CA3区Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白的表达明显低于正常对照组(P＜0.05～0.01), 致(癎)后30 d、60 d表达与正常对照组差异无统计学意义;而齿状回Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白的表达与正常对照组的差异无统计学意义.结论 颞叶癫(癎)大鼠海马CA1区、CA3区Sema3F、Np2表达在致(癎)后早期明显下调,而在慢性期恢复正常.     

G蛋白偶联内向整流钾通道亚基2 mRNA在颞叶癫疒间大鼠海马内的表达

目的探讨G蛋白偶联内向整流钾通道亚基2(GIRK 2)在颞叶癫癎大鼠海马内的表达变化.方法应用腹腔注射海人酸致癎大鼠,采用原位杂交法检测大鼠海马GIRK 2 mRNA的表达.结果 GIRK 2 mRNA在癫癎大鼠海马齿状回表达增加,与正常对照组相比差异有显著性( P<0.01).结论癫癎大鼠海马内GIRK2增高是机体对神经元网络过度兴奋的代偿反应.     

托吡酯长期应用对癫痫幼鼠学习记忆及海马NMDAR1 mRNA表达的影响

目的:研究托吡酯(TPM)长期应用对癫癎幼鼠学习记忆功能的影响,并观察海马NMDAR1 mRNA表达的变化。方法:以锂-匹罗卡品制作癫癎模型,TPM灌胃,5周后使用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆功能,通过核酸原位杂交法观察海马各区NMDAR1mRNA表达的变化。结果:癫癎幼鼠的学习记忆功能较正常幼鼠明显下降;癫癎幼鼠学习记忆功能经中、小剂量TPM干预后未发生变化,而经大剂量TPM于预后则明显下降;大鼠海马各区NMDAR1 mRNA的表达在TPM干预后无明显变化。结论:癫癎持续状态(SE)后的慢性癫癎对幼鼠的视觉空间学习记忆功能造成损害,长期大剂量应用TPM可加重这一损害,该损害可能与海马CA1、CA3区NMDAR1 mRNA的表达无关。     

匹罗卡品癫(癎)模型中蛋白质netrin-1的表达与苔藓纤维出芽的动态变化

目的:探讨神经诱向因子蛋白质netrin-1在癫(癎)持续状态后海马苔藓纤维出芽(MFS)中的作用.方法:氯化锂-匹罗卡品建立大鼠颞叶癫(癎)(TLE)模型,采用Timm染色和免疫组化的方法分别检测MFS和netrin-1在大鼠海马组织中的表达.结果:TLE组大鼠在模型形成的第2周和第4周,海马齿状回内netrin-1的表达较正常对照组明显增加,并可见到MFS,穿越齿状回颗粒细胞层到达内分子层,并形成一条致密的层状带.结论:癫(癎)状态后在海马齿状回netrin-1的表达上调,证明其可能参与了癫(癎)后MFS过程.     

匹罗卡品致(癎)大鼠海马中表达生长抑素的中间神经元数目变化及其轴突出芽

目的 探讨表达生长抑素(SS)的中间神经元在颞叶癫(癎)的发生和自我修复中的作用.方法 建立匹罗卡品致(癎)大鼠模型.免疫组织化学方法检测各时间点海马不同区域SS中间神经元的数目变化及其轴突出芽情况;结合Fluoro-Jade B(FJB)行免疫荧光双标方法特异性检测大鼠癫(癎)持续状态(status epilepticus,SE)后7 d和60 d海马不同区域SS中间神经元及其轴、树突的变性情况.结果 实验组大鼠海马各区Ss阳性神经元数目均在SE后7 d减至最低(门区11.1±3.3,CA1区2.8±0.9,CA1区1.8±0.7,t=13.519、9.644、8.808,均P<0.01),慢性期开始部分恢复,SE后60 d时CA1区SS神经元数目(12.8±1.5)超过对照组(8.8±1.3,t=-4.506,P<0.01),但门区和CA3区SS神经元数目(分别为25.5±4.6和4.8±0.8)仍明显低于正常水平(t=4.691、3.953,P<0.01);sE后30 d大鼠海马回腔隙.分子层(lacunosum-moleculare,lm)和齿状回外分子层出现大量SS染色阳性纤维,60 d时海马CA1区全层均可见大量增多的SS阳性纤维.实验组中SE后7 d的海马CA1区、60 d的CA1、CA1区和门区均可观察到少部分被FJB染色的SS中间神经元胞体及其轴、树突.结论 SS中间神经元的缺失在颞叶癫(癎)的发生中起重要作用,其缺失部分是由于神经元的变性死亡所致;慢性期CA,区SS阳性纤维大量增多,可能在颞叶癫(癎)的发生和自我修复中起重要作用.     

颞叶癫(癎)大鼠海马区NCX3 mRNA和蛋白的表达变化

目的:动态观察钠-钙交换体(NCX)mRNA和蛋白在氯化锂-匹罗卡品致(癎)模型大鼠海马CA1、CA3及齿状回区表达的变化,探讨其在癫(癎)发生发展中的作用.方法:用氯化锂-匹罗卡品制备癫(癎)动物模型;应用原位杂交和免疫组化技术检测各时间点NCX3 mRNA和蛋白的表达.结果:急性期(6～24 h)海马各区NCX3 mRNA表达均随时间的延长逐渐减少;进入静止期各区表达趋向回升,慢性反复自发发作期(30、60 d)各区表达又出现不同程度的两次下调.除致(癎)后6 h大鼠海马各区的NCX3蛋白表达无明显变化外,NCX3蛋白变化趋势与NCX3 mRNA基本一致.结论:NCX3表达下调可能通过增加神经元钙超载,改变海马神经元的兴奋性,促使癫(癎)发生.     

耐药性癫癎患者术后脑组织中Tau蛋白的表达

目的研究Tau蛋白在耐药性癫癎患者脑组织中的表达,探讨其在耐药性癫癎发病机制中的作用。方法采用免疫组化法检测48例耐药性癫癎患者海马及颞叶皮层中Tau蛋白的表达,同步观察海马苔藓纤维芽生,并与对照组进行比较。结果耐药性癫癎组和对照组脑组织中总Tau蛋白表达无明显差异,而磷酸化Tau蛋白在耐药性癫癎患者海马CA3区(0·0450±0·0115)及齿状回内分子层(0·0463±0·0120)表达增多,同步伴有海马苔藓纤维芽生(耐药性癫癎组:3·18±0·35,对照组:0·61±0·19)。结论磷酸化Tau蛋白表达增强可能是耐药性癫癎患者海马突触重建的重要机制,改变磷酸化Tau蛋白的表达有可能改善耐药性癫癎患者的预后。     

隐源性难治性颞叶癫疒间患者脑内丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5基因表达的研究

目的 检测丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5(MAPKKK5)mRNA及其编码蛋白产物在隐源性难治性颞叶癫疒间(TLE)患者脑内的表达,从分子水平探讨难治性TLE可能的发病机制.方法 取10例隐源性难治性TLE患者手术切除的颞叶组织,10例脑外伤患者(病例对照组)相应部位颞叶组织,利用RT-PCR与Western blot方法检测两组患者MAPKKK5 mRNA (MAPKKK5 mRNA/β-actin)与MAPKKK5蛋白(MAPKKK5/β-actin)的表达.结果 难治性TLE患者颞叶组织MAPKKK5 mRNA (1.001±0.321) 和MAPKKK5蛋白(0.359±0.299)的表达水平均上调,与病例对照组的(0.648±0.157)和(0.137±0.084)比较差异有统计学意义(均P<0.05).结论 MAPKKK5 基因表达上调可能参与难治性TLE的发病机制.     

颞叶癫(癎)大鼠模型内嗅皮质和齿状回内Sema3A及其受体Np1的表达变化

目的 探讨颞叶癫(癎)大鼠脑内Sema3A及其受体Np1的表达变化在癫(癎)发病中的作用.方法 SD大鼠制成颞叶癫(癎)模型,Neo-Timm染色证实苔藓纤维出芽,免疫组化和原位杂交技术对致(癎)后不同时间点内嗅皮质和齿状回的Sema3A mRNA、Np1 mRNA和蛋白表达进行分析.结果 与对照组比较,颞叶癫(癎)大鼠海马齿状回内分子层存在苔藓纤维出芽(7 d:0.70±0.42,15 d:1.50±0.52,30 d:2.20±0.41,60 d:2.50±0.51,P＜0.05);在匹罗卡品致(癎)后7 d,实验组内嗅皮质区Sema3A mRNA的表达(0.3006±0.0675)明显低于对照组(0.4562±0.0457,P＜0.01);齿状回内Np1mRNA(0.2337±0.0358)及蛋白(0.2706±0.0389)的表达亦明显低于对照组(P＜0.01).结论 内嗅皮质区Sema3A mRNA、齿状回内Np1 mRNA和蛋白的表达下调,可能参与了苔藓纤维的出芽机制.     

颞叶癫痫小鼠外周血细胞因子mRNA水平变化

目的研究颞叶癫痫小鼠发作2 h外周血IFN-α6、IFN-γ、IL-1β以及TNFR-m18等细胞因子变化情况。方法采用real-time PCR法检测癫痫发作后10 min、30 min、1 h和2 h癫痫小鼠外周血中IFN-α6、IFN-γ、IL-1β以及TNFR-m18 m RNA的表达。结果癫痫组30 min时IL-1βm RNA的表达水平与对照组及SE10 min比较均升高(P0.05);癫痫组10 min时IFN-α6 m RNA表达水平低于对照组(P0.05);IFN-γm RNA表达水平在SE10 min时与对照组及SE其他时间点相比有统计学差异(P0.05);TNFR-m18 m RNA表达水平在SE 1 h时与对照组及SE其他时间点(10 min、30 min、2 h)相比升高(P0.01)。结论癫痫状态下外周血中细胞因子m RNA表达水平失衡,可能与急性期癫痫的免疫病理过程有关。     

Induction of sodium channel Nax (SCN7A) expression in rat and human hippocampus in temporal lobe epilepsy

Purpose: In a recent large‐scale gene‐expression study in a rat model of temporal lobe epilepsy (TLE) a persistent up‐regulation in the expression of the SCN7A gene was revealed. The SCN7A gene encodes an atypical sodium channel (Na_x), which is involved in osmoregulation via a sensing mechanism for the extracellular sodium concentration. Herein we investigated the expression and cellular distribution of SCN7A mRNA and protein in normal and epileptic rat and human hippocampus. Methods: SCN7A/Na_x expression analysis was performed by polymerase chain reaction (PCR), immunocytochemistry, and western blot analysis. Results: Increased expression of SCN7A/Na_x mRNA/protein was observed during epileptogenesis and in the chronic epileptic phase in the post–status epilepticus (SE) model of TLE. The up‐regulation was confirmed in human hippocampal tissue resected from pharmacoresistant patients with hippocampal sclerosis (HS). In both epileptic rat and human hippocampus, increased Na_x expression was observed in neurons and reactive astrocytes compared to control tissue. Conclusions: The increased and persistent expression of SCN7A/Na_x in the epileptic rat and human hippocampus supports the possible involvement of this channel in the complex reorganization occurring within the hippocampus during the epileptogenic process in TLE. Further studies are needed for a complete understanding of the functional role of SCN7A in epilepsy.     

难治性颞叶癫(癎)的相关基因表达谱

目的 筛选难治性颞叶癫(癎)相关基因表达谱,并通过对表达谱筛选所发现的差异基因进行验证,从分子水平探讨颞叶癫(癎)可能的发病机制.方法 在利用基因芯片对难治性颞叶癫(癎)患者手术切除颞叶组织与对照间行基因表达谱分析研究的基础上,扩大样本量,应用RT.PCR方法,验证SH3GL2、BTN2A2、KCNJ4基因的mRNA在颞叶癫(癎)患者脑内的表达差异.结果 芯片研究结果显示,颞叶癫(癎)脑组织标本与对照组相比,表达趋势一致的已知基因包括:免疫相关因子、离子通道相关因子、信号转导相关基因、细胞增殖周期因子、细胞凋亡相关基因等;经RT.PCR证实,颞叶癫(癎)组突触重建调控因子SH3GL2的mRNA表达水平(1.022±0.547)明显高于对照组(0.446±0.171,t=-3.181),免疫调控基因BTN2A2的mRNA表达在颞叶癫(癎)组(0.481±0.196)同样高于对照组(0.243±0.111,t=3.351),而编码内向整流钾通道亚单位基因KCNJ4 mRNA的表达水平在颞叶癫疴组(0.438±0.178)则明显低于对照组(0.795±0.112),差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在颞叶癫(癎)发生发展各个阶段均有基因的参与,是一个复杂的调控过程;芯片试验结果对进一步探讨疾病可能的发病机制以及为探求疾病治疗的新靶点提供了依据.     

氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马结构中CLC-2、CLC-3氯通道表达变化的研究

目的 研究ClC-2、ClC-3氯通道在氯化锂-匹罗卡品大鼠慢性癫痫模型中分布和表达的变化,探讨其在癫痫发作病理机制中的作用.方法 Wistar大鼠采用随机数字表法分成致痫组(60只)与对照组(20只),其中致痫组根据处死及处理时间又分为24h组、14d组与30d组,每组20只.致痫组复制氯化锂-匹罗卡品大鼠慢性癫痫模型,在发作后24h、14d、30d时,分别予以:(1)免疫组化染色,观察ClC-2、ClC-3氯通道蛋白在海马表达的分布情况及其致病后不同时点的吸光度(A)值的变化;(2)RT-PCR,观察ClC-2、ClC-3氯通道mRNA在致痫后不同时点的变化.结果 (1)与对照组比较,致痫后14d至30d,致痫组免疫反应阳性神经元数和A值明显减少和降低,差异有统计学意义(P<0.05);ClC-2 mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05).(2)与对照组比较,致痫组致痫后24 h,海马CA1、CA3及齿状回各层ClC-3免疫反应阳性神经元数和A值明显增加和升高,差异有统计学意义(P<0.05);ClC-3氯通道mRNA表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 癫痫慢性期的发作和ClC-2氯通道的减少有关.     

匹罗卡品致痫大鼠海马一氧化氮水平和caspase-3 mRNA表达的动态变化

目的探讨大鼠癫(疒间)持续状态(SE)后海马一氧化氮(NO)与caspase-3 mRNA表达的改变及相互关系.方法采用匹罗卡品腹腔注射建立大鼠SE模型,用比色法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术在不同时相点检测大鼠海马NO水平与caspase-3 mRNA的表达.结果大鼠海马NO含量在SE后6 h迅速升高,48～72 h虽有所降低,但仍明显高于对照组(均P<0.01);SE后7 d,海马NO含量仍高于正常,但差异无显著性.大鼠海马caspase-3 mRNA表达于SE后6 h开始增多(P<0.05),SE后48 h达到高峰(P<0.01),72 h开始降低,SE后7 d,caspase-3 mRNA表达仍高于对照组,但差异无显著性(P>0.05).结论 caspase-3 mRNA表达升高在NO水平升高之后,并与NO保持相似的变化趋势,提示SE后caspase-3的激活可能与NO神经毒性作用有关.     

雌激素调控瞬时外向钾通道对大鼠慢性颞叶癫发作的影响

目的探讨雌激素对大鼠慢性颞叶癫发作的影响及其与瞬时外向钾通道(kv4.2)之间的关系。方法 SD雌性大鼠随机分为正常对照组、去势对照组、正常致组、去势致组。应用毛果芸香碱诱导大鼠癫持续状态(SE),观察大鼠行为学变化。经4周后成为慢性颞叶癫大鼠。Western bolt方法检测大鼠海马瞬时外向钾通道Kv4.2蛋白表达水平。结果与正常致组比较,去势致组达到SE的潜伏期延长、死亡率降低,但差异无统计学意义(P0.05);去势致组的癫发作强度较正常致组轻,差异有统计学意义(P0.05)。去势致组和正常致组在SE 4周后海马Kv4.2均较正常对照组显著升高,均差异有统计学意义(P0.05和P0.01)。去势对照组和去势致组比较,均未见对Kv4.2蛋白表达产生影响,说明Kv4.2蛋白表达升高为癫发作所致。结论大鼠癫发作后Kv4.2表达增加、瞬时外向钾电流增强、神经冲动的发放频率减慢,可能是产生代偿性自我保护反应的结果;虽然去势雌性大鼠未对Kv4.2表达产生影响,但出现潜伏期延长和死亡率降低、发作强度降低的行为学趋势,提示低剂量雌激素可能存在对癫发作的保护作用。     

褪黑素对癫(癎)大鼠海马神经元凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的观察褪黑素（Mel）对癫癇大鼠海马神经元凋亡及半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3表达的影响。方法采用匹罗卡品（Pilo）制作大鼠癫癇持续状态（SE）模型,随机分为Pilo组、Mel组和对照组,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）染色和免疫组化技术检测大鼠海马神经元凋亡数和caspase-3的表达,并与对照组比较。结果SE后6h,Pilo组开始出现少量TUNEL阳性细胞;SE后72h,达到高峰;SE后7d,TUNEL阳性细胞开始减少。SE后6h,Pilo组大鼠海马caspase-3阳性细胞数增多,主要集中于CA1和CA3区;SE后48h,达到高峰;SE后72h,阳性细胞数开始减少;SE后7d,caspase-3表达基本恢复正常。Mel组各时间点大鼠海马TUNEL阳性细胞数和caspase-3表达均明显低于Pilo组大鼠（均P〈0.01）。结论Mel可减少癫癇大鼠海马神经元凋亡,抑制caspase-3的表达,起到神经保护作用。