CD44基因变异体对人乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭作用

目的 探讨一种新的CD44基因变异体(CD44v17)对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响及其机制.方法 以人乳腺癌耐阿霉素细胞株(MCF-7/ADR)cDNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,将其T-A克隆后,进行测序;构建CD44v17质粒真核表达载体(pcDNA3.1-CD44v17);应用脂质体转染法将pcDNA3.1-CD44v17转染入MCF-7细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及明胶酶谱法测定转染细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达;Transwell法检测CD44v17对MCF-7细胞的侵袭力;Western blot检测胞外信号调节蛋白激酶(ERK)及磷酸化蛋白激酶(p-ERK)变化.结果 限制性内切酶消化证实,重组载体已正确克隆;DNA序列分析显示,CD44v17包含CD44基因1～4号外显子、16～17号外显子、18号外显子1～205位碱基(GeneBank NO.FJ216964).MCF-7细胞转染peDNA3.1-CD44v17后,CD44 mRNA表达量和蛋白表达率分别为0.92±0.22和(70.0±2.5)%;透明质酸(HA)处理后,MMP-2 mRNA表达量和蛋白活性分别为0.72±0.22和1.14.4-0.12,MMP-9 mRNA表达量和蛋白活性分别为0.85±0.19和1.23±0.25,细胞侵袭能力明显增加,侵袭细胞数目为352±33个/视野,而CD44单抗可以阻断这种作用;CD44单抗和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂预处理转染细胞后,显著阻断了P-ERK的表达.结论 在MCF-7/ADR细胞中发现CD44v17,并成功克隆和建立pcDNA3.1-CDd4v17;HA与CD44v17受体结合,通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2和MMP-9的表达,从而增加MCF-7细胞的侵袭力.     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

TNF-α对人乳腺癌MCF-7细胞株CD44表达以及细胞侵袭性的影响

目的:检测TNF-α作用前后人乳腺癌细胞株MCF-7中CD44s、CD44v3和CD44v6的表达水平的变化,及对细胞侵袭能力的影响.方法:采用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α作用前后人乳腺癌细胞株MCF-7中CD44s、CD44v3和CD44v6的表达情况,了解TNF-α对CD44各亚型表达水平的影响;Transwell检测TNF-α作用前后人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭力的变化情况.结果:TNF-α作用后,MCF-7细胞株CD44s mRNA表达下降,CD44v3 mRNA和CD44v6 mRNA的表达上升.相应蛋白表达与mRNA水平呈现一致性改变,其中CD44s蛋白表达下降,CD44v3蛋白和CD44v6蛋白表达上升;TNF-α作用后细胞侵袭力提高(P＜0.001).结论:在人乳腺癌细胞株MCF-7中,TNF-α可能通过影响CD44各亚型mRNA和蛋白表达水平,进而促进肿瘤细胞的侵袭能力.     

AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响

目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.     

长链非编码RNA CARMN对乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨长链非编码RNA心脏中胚层增强子相关非编码RNA(CARMN)在乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭过程中的作用及其对Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的影响。方法 通过UALCAN分析CARMN在乳腺癌组织的表达，实时荧光定量PCR(qPCR)检测CARMN在正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和乳腺癌细胞(MCF-7)的表达。将MCF-7细胞分为NC组(无转染处理)、OE-CARMN组(转染pcDNA3.1-CARMN以过表达CARMN)和si-CARMN组(转染si-CARMN以干扰CARMN表达)。利用CCK-8法、细胞集落形成实验、划痕愈合实验和Transwell小室实验检测MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭情况；qPCR和Western blot检测无翅型MMTV整合位点家族成员1(Wnt1)、β-catenin和基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达。结果 CARMN在乳腺癌组织和MCF-10A细胞中均表达下调(P<0.05)。OE-CARMN组MCF-7细胞活力、细胞集落数、划痕愈合率和侵袭细胞数量均低于NC组(P<0.05),而si-CARMN组MC...     

hCLP46基因在不同侵袭转移潜能乳腺癌细胞表达中的差异及其意义

目的 探讨hCLP46基因在MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达的差异性及其意义。方法 采用RT-PCR的方法检测2个细胞系(乳腺癌低度侵袭转移细胞系MCF-7、中度侵袭转移细胞系MDA-MB-231)中hCLP46 mRNA的表达差异。取MCF-7和MDA-MB-231细胞株进行培养,分别加入100 μmol/L的转化生长因子-β(TGF-β)并设对照组,培养72 h,用Western-blot方法分析P15蛋白表达。结果 RT-PCR检测hCLP46结果显示,在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中,内参基因GAPDH的表达量相近,hCLP46基因在两个细胞系中均表达,其中MDA-MB-231细胞系中的表达高于MCF-7细胞系。两个细胞系分别加入TGF-β培养72 h后,与相应的对照细胞系相比,P15的表达均有降低,hCLP46基因高表达的MDA-MB-231细胞中P15表达较MCF-7细胞显著降低。结论 hCLP46基因过表达可能抑制TGF-β对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞P15基因的上调,hCLP46可能在乳腺癌的发病中起到一定作用。     

沉默CD44表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与侵袭的影响

目的:探索乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7中CD44分子的表达水平差异及沉默CD44对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移的影响。方法:利用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平;设计并合成CD44的siRNA片段(CD44-siRNA)转染乳腺癌细胞,利用qRT-PCR、Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平的变化;MTT检测MDA-MB-231细胞增殖;Transwell侵袭实验检测MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力变化。结果:CD44在侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达高于非侵袭性乳腺癌细胞MCF-7,CD44-siRNA下调了 MDA-MB-231细胞中CD44 mRNA与蛋白水平的表达,并抑制了细胞的增殖和侵袭转移能力。结论:CD44-siRNA能够下调CD44的表达,并有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖及其侵袭迁移力。     

乳腺癌MCF-7细胞通过TGF-β诱导的上皮-间质转化获得耐药北大核心CSCD

目的:通过研究高侵袭转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和低侵袭转移性细胞株MCF-7中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和耐药的相关性,以探讨乳腺癌耐药的机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和纤黏蛋白(bronectin)以及转录因子Snail、Slug和锌指E-box同源结合框1(Zincnger E-box binding homeobox 1,ZEB1)mRNA的表达水平;划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移和侵袭能力;CCK-8法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇的敏感性,并采用实时荧光定量PCR法检测耐药基因多重耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MDR1)和MDR相关蛋白1(MDR-associated protein,MRP1)mRNA的表达水平。用转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导MCF-7细胞发生EMT,或用靶向E-cadherin基因的E-cadherin-siRNA沉默EMT相关标志物E-cadherin的表达,再用CCK-8法检测MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶敏感性的变化。结果:MDA-MB-231细胞中vimentin、fibronectin、Slug和ZEB1 mRNA的表达水平均高于MCF-7细胞(P值均<0.000 1),E-cadherin mRNA的表达水平明显低于MCF-7细胞(P=0.000 2),Snail mRNA的表达水平无明显差异。与MCF-7细胞相比,MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显更强(P值均<0.000 1);5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇对MDAMB-231细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值明显高于MCF-7细胞(P值均<0.05);MDA-MB-231细胞中耐药相关基因MDR1和MRP1 mRNA表达水平明显更高(P值均<0.000 1)。TGF-β诱导MCF-7细胞发生EMT后,5-氟尿嘧啶对MCF-7细胞的IC50值明显上升(P<0.05);沉默E-cadherin表达后,MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性明显增强(P<0.05)。结论:乳腺癌中EMT和耐药存在相关性,诱导EMT发生可导致细胞耐药。     

VEGF上调survivin和bcl-2表达及抑制乳腺癌细胞凋亡的机制探讨

目的研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)对乳腺癌细胞株MCF-7的凋亡及凋亡相关基因survivin和bcl-2表达的影响,探讨VEGF自分泌作用抑制肿瘤细胞凋亡的机制.方法构建VEGF165真核表达质粒,采用脂质体转染VEGF165 cDNA MCF-7细胞, 通过RT-PCR及ELISA方法鉴定转染克隆MCF-7/hVEGF165细胞中VEGF mRNA及蛋白的表达,Western blot 方法比较MCF-7/hVEGF165及MCF-7、MCF-7/pcDNA3细胞中survivin、bcl-2蛋白表达,流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期.结果 MCF-7/hVEGF165细胞VEGF mRNA表达量增加,细胞培养上清中VEGF蛋白浓度为(354.50±31.93)ng/L,高于MCF-7细胞的(178.54±16.52)ng/L和MCF-7/pcDNA细胞的(190.75±13.32)ng/L(P<0.01).与MCF-7、MCF-7/pcDNA3组相比较,MCF-7/hVEGF165细胞凋亡百分数显著下降(P<0.05),分别为(2.47±0.51)% (MCF-7/hVEGF165),(7.74±1.56)%(MCF-7/pcDNA3)和(7.35±0.33)%(MCF-7);survivin和bcl-2蛋白表达增高了近3倍,但各组细胞周期变化不明显(P>0.05).结论 VEGF诱导凋亡抑制基因suvivin和bcl-2高表达,可能在自分泌VEGF抑制MCF-7凋亡中发挥重要作用.     

靶向 CK18 的shRNA表达载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的： 构建靶向人角蛋白18（cytokeratin 18, CK18 ）基因的shRNA真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MCF-7细胞株,观察其对MCF-7细胞增殖的影响。 方法： 设计两条靶向 CK18基因 的RNA干扰序列,命名为CK18-shRNA1、CK18-shRNA2,同时设计阴性对照,将合成的寡核苷酸链与Psilencer3.1-H1/Hygro质粒连接形成重组质粒,并经脂质体介导稳定转染MCF-7细胞,G418筛选后扩增获得稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞株中 CK18 mRNA和蛋白的表达,并进一步通过MTT法检测重组表达载体稳定转染对细胞增殖的影响。 结果： 重组表达载体（Psilencer3.1-CK18-shRNA1、Psilencer3.1-CK18-shRNA2和Psilencer3.1-NC-shRNA）经PCR及DNA测序分析证明序列插入正确,经500 μg/ml G418筛选出稳定转染Psilencer3.1-CK18-shRNA的MCF-7细胞,Psilencer3.1-CK18-shRNA2转染可有效抑制MCF-7细胞中 CK18 mRNA和蛋白的表达,而Psilencer3.1-CK18-shRNA1转染不影响MCF-7细胞中 CK18 mRNA和蛋白的表达水平。与阴性对照Psilencer3.1-NC-shRNA组相比,Psilencer3.1-CK18-shRNA2转染可有效抑制MCF-7细胞的增殖\[（0.40±0.01） vs （0.55±0.06）,P<0.05\]。 结论： 靶向 CK18 的shRNA表达载体稳定转染细胞后可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖。     

Snail促进乳腺癌MCF-7细胞移植瘤对多柔比星的耐药及其机制

目的:探讨Snail在乳腺癌MCF-7细胞移植瘤对多柔比星耐药中的作用及其可能的机制。方法:构建Snail基因真核表达载体pcDNA3.1-Snail,转染至MCF-7细胞,筛选稳定表达Snail的MCF-7/Snail细胞,以转染空质粒pcDNA3.1的MCF-7细胞(MCF-7/pcDNA)为对照。构建小鼠MCF-7/Snail及MCF-7/pcDNA细胞移植瘤模型,注射多柔比星,观测移植瘤生长,计算抑瘤率。免疫组织化学方法检测移植瘤组织中Snail、多药耐药基因-1(multidrug resistance-1,MDR-1)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达。结果:成功构建pcDNA3.1-Snail表达载体,转染MCF-7细胞后获得MCF-7/Snail和MCF-7/pcDNA细胞,并制备小鼠移植瘤。多柔比星治疗后,MCF-7/Snail细胞移植瘤的瘤重明显高于MCF-7/pcDNA细胞移植瘤[(1.413±0.674)g vs(1.257±0.576)g,P<0.05],多柔比星对MCF-7/Snail移植瘤抑瘤率明显低于MCF-7/pcDNA移植瘤(18.42%vs30.18%,P<0.05),MCF-7/Snail细胞移植瘤的组织中Snail、MDR-1、MMP-9的表达均显著高于MCF-7/pcDNA移植瘤(408.08±20.39vs67.67±16.56,363.50±26.56vs55.08±12.23,396.25±16.03vs56.92±7.35;均P<0.01),且Snail与MDR-1和MMP-9的表达均呈正相关(r1=0.89,P<0.01;r2=0.81,P<0.01)。结论:Snail促进乳腺癌MCF-7细胞移植瘤对多柔比星的耐药,其机制与增强MDR-1和MM9-9表达有关。     

CD24在大肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖的影响

目的探讨CD24对大肠癌SW480细胞的增殖作用。方法应用免疫组织化学方法,检测大肠癌及癌旁正常组织中CD24的表达情况,用pcDNA3.1（＋）载体构建CD24的表达质粒[pcDNA3.1（＋）-CD24],应用半定量RT-PCR和流式细胞术,检测CD24 mRNA和蛋白水平的表达情况,应用CCK-8法,检测SW480及转染重组质粒的细胞体外增殖情况。结果 CD24在大肠癌组织中的染色定位于细胞膜和细胞质,膜表达和质表达阳性率分别为34.9%和89.6%,质表达水平与肿瘤病理分级和分期呈正相关性;成功地构建了pcDNA3.1（＋）-CD24表达质粒并瞬时转染SW480细胞,质粒转染组在转染48、72和96 h时,细胞活性较阴性对照组和空白对照组明显增强（P〈0.01）。结论 CD24在大肠癌组织中呈高表达,而且可促进大肠癌细胞的体外增殖作用,提示CD24在大肠癌发生发展中起重要作用。     

β-榄香烯对MCF-7／ADM细胞株中乳腺癌干细胞作用的初步研究

目的探讨乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADM与阿霉素敏感细胞株MCF-7／S中乳腺癌干细胞（BCSCs）含量及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和P-糖蛋白（P-gp）表达的差异,观察中药β-榄香烯（β-ELE）对BCSCs及BCRP和P-gp表达的影响。方法 应用无血清细胞培养法培养MCF-7／ADM和MCF-7／S细胞株,形态学观察不同细胞株无血清细胞球培养的成球率,RT PCR检测两种细胞株中BCRP和P-gp的mRNA水平,流式细胞仪检测BCRP和P-gp的阳性表达率及CD44+CD24^-／low细胞比例。应用15μg/ml β-ELE作用MCF-7/ADM细胞株48h后,检测细胞成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白表达的变化。结果 与MCF-7／S细胞比较,MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp mRNA水平较高。MCF-7／ADM细胞中BCRP和P-gp蛋白的阳性表达率分别为（77.78±9.55）％和（32.33±5.12）％,CD44+CD24-／low细胞比例为（64.79±11.78）％,均高于MCF-7／S细胞的（3.97±1.51）％、（14.26±2.51）％和（18.79±3.28）％,差异均有统计学意义（P＜0.01）。β-ELE能明显抑制MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白的表达（P＜0.01）。结论 MCF-7／ADM是BCSCs相对富集的一种耐药细胞株且高表达BCRP和P gp,β-ELE能够抑制MCF-7／ADM细胞中BCSCs比例及其成球率,并降低耐药蛋白的表达。     

氯离子通道1过表达对小鼠肝癌细胞株Hca-P生物学行为的影响

背景与目的:氯离子通道l(chloride intracellular channel l,CLICl)是CLIC家族中的一员,研究表明CLIC1与肿瘤转移相关。本研究旨在探讨CLICl过表达在体外对小鼠肝癌低淋巴道转移细胞株Hca-P生长、体外迁移和侵袭能力的影响。方法:构建CLIC1过表达真核载体pcDNA3.1(+)-CLIC1表达质粒,将重组的pcDNA3.1(+)-CLIC1基因和空载体pcDNA3.1(+)转染Hca-P母系细胞,通过G418筛选获得稳定表达CLIC1基因的pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P细胞株和转染空载体的pcDNA3.1(+)-Hca-P细胞株,RT-PCR和ELISA鉴定CLIC1过表达水平,CCK-8法检测细胞活力和分裂增殖能力,Transwell实验检测细胞的体外迁移能力和侵袭能力。结果:成功建立了稳定表达CLIC1基因的细胞株pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P,与空载体对照组相比,pcDNA3.1(+)-CLIC1质粒转染入Hca-P细胞后CLIC1基因表达水平显著升高。pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P细胞增殖明显高于Hca-P母系细胞组和空载体对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且细胞增殖主要集中在72～96 h;Transwell检测各组肿瘤细胞迁移能力结果显示,pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P、pcDNA3.1(+)-Hca-P和Hca-P细胞株迁移到膜下和小室下室的平均细胞数分别为205.43±22.87、132.72±20.45和121.35±19.64。pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P与Hca-P、pcDNA3.1(+)-Hca-P细胞株比较差异有统计学意义(P<0.05);Transwell检测各组肿瘤细胞侵袭能力结果显示,pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P细胞穿过基膜的细胞数为(76.2±4.62)个,明显多于pcDNA3.1(+)-Hca-P的穿膜细胞数(48.34±3.45)个和Hca-P细胞的穿膜细胞数(49.8±5.51)个,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CLIC1过表达可以显著促进Hca-P细胞增殖、增强其侵袭能力。CLIC1有望成为临床治疗肝癌的基因治疗靶点之一。     

肿瘤相关巨噬细胞对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

目的观察肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响,并初步探索其机制。方法选取人单核细胞系THP-1,体外经佛波酯(PMA)、人白细胞介素-4(IL-4)诱导获得TAMs细胞模型;通过流式细胞术(FCM)检测TAMs表面标记分子CD206表达水平;MCF-7细胞与TAMs共培养后,光学倒置显微镜观察细胞形态;利用Transwell小室分别检测MCF-7细胞的侵袭和迁移能力;蛋白印记法(Western blotting)检测E-钙黏蛋白(Ecadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、闭合蛋白(Occludin)及波形纤维蛋白(Vimentin)的表达;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养上清中转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的浓度。结果与TAMs共培养后的MCF-7细胞伪足增多,细胞排列更松散。通过FCM检测到TAMs表面标记物CD206显著表达。Transwell实验结果显示,与TAMs共培养后的MCF-7细胞迁移能力增...     

CD44与抗乳腺癌药物耐药性的关系

细胞黏附分子CD44抗原与乳腺癌化疗耐药密切相关.其高表达能显著增强乳腺癌侵袭能力.CD44主要通过影响细胞转化生长因子-β(TGF-β)表达来促进乳腺癌细胞对三苯氧胺产生耐药性,而对erbB-2信号通路的调节是CD44影响乳腺癌曲妥珠单抗耐药的重要方式.通过诱导多药耐药相关蛋白(MRP)2上调及对拓扑异构酶Ⅱ的抑制,CD44加强了乳腺癌对蒽环类药物的耐药.而对sur-vivn蛋白及多药耐药基因的调节增强了乳腺癌对紫杉类药物的耐药性.     

乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的上皮间质化现象及机制

目的:建立乳腺癌阿霉素耐药细胞株,命名为MCF-7/ADM,探讨耐药细胞的上皮间质化(EMT)现象及机制,为耐药乳腺癌的治疗奠定基础.方法:中等浓度间歇法建立乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM.采用MTT和Transwell实验分别检测耐药对细胞增殖、迁移与转移能力的影响;荧光定量PCR检测MCF-7/ADM细胞EMT相关分子标志物E-钙黏蛋白及间质细胞分子标记N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白等的表达.ELISA检测TGF-β的表达,Western blot检测TGF-β及Smad2/3在蛋白水平的表达.结果:乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM的耐药指数为32.2,对5-氟脲嘧啶、顺铂、环磷酰胺产生交叉耐药性.与MCF-7细胞相比,MCF-7/ADM细胞迁移和转移能力明显增强,E-cadherin表达降低而N-cadher-in表达显著增高,细胞上清中TGF-β1表达增加,细胞内TGF-β及磷酸化Smad2/3在蛋白水平表达升高.结论:乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM发生EMT现象,可能与经典TGF-β通路激活有关.     

转染IkBα基因抑制NF-KB活性对A549细胞侵袭行为的影响

背景与目的:近年来的研究显示核因子-KB(nuclear factor-kB, NF-kB)的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移.本研究探讨抑制NF-kB的活性对A549细胞侵袭能力的影响及其可能的机制.方法:构建表达NF-kB抑制物a同分异构体(inhibitor of NF-kB, α isoform, IkBα)的真核表达重组质粒pcDNA3.1( )/IkBα.体外培养A549细胞,分为未转染组(不转染质粒)、转染pcDNA3.1( )组、转染pcDNA3.1( )/IkBα组,分别转染相应的质粒.应用RT-PCR、Western blot检测各组细胞IkBα的表达情况,应用凝胶电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测各组细胞NF-kB的活性,应用Transwell侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力,应用RT-PCR方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9的mRNA水平,应用明胶酶谱法检测各组细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的活性.结果:酶切鉴定结果显示pcDNA3.1( )/IkBα质粒构建成功.RT-PCR和Western blot检测结果表明构建的pcDNA3.1( )/IkBα质粒能够在A549细胞中表达IkBα.转染pcDNA3.1( )/IkBα组A549细胞NF-kB活性、侵袭细胞数目、MMP-2活性及MMP-9活性均低于未转染组和转染pcDNA3.1( )组(P值均<0.05),而转染pcDNA3.1( )组与未转染组之间的差异均无统计学意义(P值均>0.05).结论:转染IkBα基因能够抑制A549细胞中NF-KB的活性.NF-kB的活性下降能够抑制A549细胞的侵袭能力,其机制可能与MMP-2、MMP-9表达下调有关.     

他莫昔芬对转染ERβ1基因的MCF-7细胞生长特性的影响

目的研究在不同处理因子作用下,外源基因ERβ1的表达对MCF-7乳腺癌细胞系生长特性的影响。方法利用脂质体转染方法将ERβ1真核表达载体pcDNA3.1-EGFPERβ1导入MCF-7乳腺癌细胞系。采用Western blot方法检测转染细胞中ERβ1的蛋白表达水平,筛选阳性克隆。以亲本细胞MCF-7为对照,分别在雌激素和雌激素受体拮抗剂他莫昔芬作用下观察细胞的生长特点。结果在转染ERβ1基因的MCF-7细胞系中,Western blot检测证实ERβ1的蛋白表达水平显著增高。在无处理因子的情况下,外源基因ERβ1在MCF-7细胞系中的表达能抑制细胞生长。与亲本细胞MCF-7细胞相比,转染ERβ1的MCF-7细胞对雌激素的敏感性下降,但对他莫昔芬的敏感性无明显变化。结论外源性ERβ1基因在MCF-7乳腺癌细胞中的稳定表达不增加对他莫昔芬的耐药性,但使之对雌激素的敏感性下降。