蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

卡介苗D2株分泌蛋白基因植物表达载体的构建

目的克隆卡介苗(BCG)D2株32-kDa分泌蛋白基因(fbpA基因),构建重组植物表达载体pBI121-fbpA,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础.方法采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因,构建重组克隆载体pUCm-T-fbpA,经过单菌落PCR法、BamHⅠ、SacⅠ和HindⅢ单双酶切、DNA序列分析鉴定后,将fbpA基因亚克隆入植物表达载体pBI 121,得到重组载体pBI 121-fbpA,并转化根癌农杆菌株EHA105,用PCR法对其进行鉴定.结果重组载体pUCm-T-fbpA测序后证实fbpA基因由1 041 bp组成,包括1个1 014 bp的开放阅读框.DNA序列上游由编码一段信号肽的129 bp组成,并对32-kDa蛋白的分泌起决定作用.相应的编码成熟蛋白的序列由885个碱基组成.fbpA基因与来源于BCG1173P2株的同一基因序列完全一致.此外,构建的重组植物表达载体pBI121-fbpA成功转入根癌农杆菌株EHA105.结论编码BCGD2株32-kDa分泌蛋白的fbpA基因分离成功,DNA序列分析证实fbpA基因在分枝杆菌中高度保守,为进一步深入分析fbpA基因以及研制抗结核病转基因植物疫苗奠定了基础.     

新型人白细胞介素—2（125—Ser）表达载体的构建和大肠杆菌中的表达

目的：构建新型人白细胞介素－2（125－Ser）的表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：用PCR技术对天然人IL－2基因进行突变,并与表达载体pET-11b连接,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达。结果：将编码天然人IL－2的125－Cys的密码子（TGT）变成了编码125－Ser的密码子（TCT）,在大肠杆菌中表达量达27％。结论构建了表达新型人IL-2(125－Ser)的表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为后续的复性和纯化工作奠定了良好的基础。     

Myocardin亲水区原核表达载体的构建

目的:针对不同种属(小鼠、大鼠、人)的myocardin序列进行比对,并通过理化性质分析,在同源区域中选择兼具备抗原性和亲水性较强的基因片段,构建重组质粒.方法:通过聚合酶链反应(PCR)以Q935为模板制备Myocardin目的 基因,通过pET22b载体线性化以及连接、转化等方法构建原核表达载体pET22b-Myo...     

小鼠Calb2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:为了体外研究Calretinin(Calb2)基因在生殖系统、神经系统、视觉传导中的作用,构建小鼠Calb2基因表达重组腺病毒载体.方法:用反转录聚合酶链反应( RT-PCR)方法,以小鼠Calb2 cDNA为模板,扩增Calb2基因.亚克隆后,将Calb2基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,...     

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白β、α亚基基因的克隆及各亚基原核表达载体的构建与表达

目的 克隆钝顶螺旋藻藻蓝蛋白(CPC)β、α亚基的基因序列,分别构建β和α亚基的原核表达载体,并在大肠杆菌内表达这2个亚基.方法 首先利用PCR技术扩增钝顶螺旋藻藻蓝蛋白基因序列,将扩增产物克隆入pGEM-Teasy载体内,测序分析插入片段的正确性.然后以克隆的cpc基因为模板分别扩增藻蓝蛋白的β和α亚基的编码基因cp...     

2型糖尿病患者脂肪组织内蛋白酪氨酸磷酸酶的蛋白表达

目的研究2型糖尿病患者脂肪组织内胰岛素受体后信号传导分子蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)和含2个SH2结构的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase with two src-homology 2,SH-PTP2)的蛋白表达,探讨人体脂肪组织产生胰岛素抵抗的分子机制。方法用Western blot技术检测来自民航总医院及北京大学第一医院外科住院,并接受腹部手术治疗的患者[根据口服葡萄糖耐量试验的结果将其分为2型糖尿病组(n=10)和非糖尿病对照组(n=10)]的皮下及其大网膜脂肪组织内PTP1B、SH-PTP2的蛋白表达水平。结果 PTP1B的蛋白表达(IA)在2型糖尿病患者皮下(24.14±0.67)及其大网膜脂肪组织内(28.35±1.12)均较对照组增加[皮下14.53±0.52(P=0.042);大网膜18.65±2.84(P=0.035)];SH-PTP2在其皮下(42.14±6.67)及大网膜脂肪组织内(41.88±11.57)的蛋白表达虽然亦较对照组(皮下35.34±8.21;大网膜29.98±6.38)增加,但差异无统计学意义。结论 2型糖尿病患者脂肪组织内PTP1B及SH-PTP2蛋白表达的异常改变,可能是引起其产生胰岛素抵抗的分子机制之一。     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

HCV NS3解旋酶基因原核表达载体pGEX-4T-1的构建

[目的]构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3解旋酶基因原核表达载体,为进一步研究和解析NS3的解旋酶基因对病毒复制的机制准备条件.[方法]将含有NS3基因的pMD-24/HCV NS3质粒转化感受态菌DH-5α并扩增;提取pMD-24/HCV NS3质粒;从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出NS3解旋酶基因;并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与表达载体pGEX-4T-1重组,以得到重组的原核表达载体pGEX-4T-1/NS3解旋酶.[结果]从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出的NS3解旋酶基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列:电泳结果证明已将此片段克隆到pGEX-4T-1内.[结论]成功地构建了HCV NS3解旋酶基因的原核表达载体DGEX-4T-1/NS3解旋酶.     

SARS冠状病毒M蛋白基因的克隆、鉴定及原核表达载体的构建

目的 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SARS冠状病毒M蛋白基因,并构建M蛋白基因的原核表达载体,为进一步研究其功能做准备。方法 提取SARS冠状病毒总RNA,通过RT-PCR对其M蛋白基因进行扩增,并构建M蛋白基因的原核表达载体。结果 获得了SARS冠状病毒M蛋白基因的编码序列并将其克隆入原核表达载体pEq30a。结论 成功构建SARS冠状病毒M蛋白基因的重组表达质粒,为进一步研究打下基础。     

修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体的构建

目的 构建人修复基因hMTH1反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.方法 提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hMTHI基因cDNA保守序列，经pGEMT载体克隆后双酶切，将cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl，构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，并转染细胞。用Western-blot法检验载体抑制hMTH1蛋白表达的效率。结果 经RT-PCR获得423bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为hMTH1基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T，测序后确证。该载体转染细胞后，可使hMTH1蛋白水平下降约46％。结论 成功构建hMTH1基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-T.     

色素框同源蛋白7基因在人体多种癌组织中表达下调

目的 研究色素框同源蛋白7(cbx7)基因在结肠癌、胃癌和肝癌组织中的表达变化,探讨这种表达变化与肿瘤发生和发展的相关性.方法 收集22例结肠癌患者、20例胃癌患者、30例肝癌患者的肿瘤组织及其切缘组织标本、临床病理资料和随访资料.提取各标本RNA,用荧光定量PCR检测cbx7 mRNA含量,分析肿瘤组织中cbx7 mRNA表达水平与患者临床特征相关性及与患者术后生存时间的关系.结果 结肠癌、胃癌和肝癌组织中cbx7 mRNA的相对拷贝数分别为0.010±0.015、0.197±0.195、0.008±0.008;对应各癌组织的切缘正常组织中cbx7 mRNA的相对拷贝数分别为0.053±0.042、1.891±1.254、0.030±0.021.与切缘正常组织相比,3种癌组织中的cbx7 mRNA含量均明显下调(结肠癌:t=-7.351,P<0.01;胃癌:t=-5.417,P<0.01;肝癌:t=-6.680,P<0.01).结肠癌患者中,年龄>55岁组cbx7 mRNA相对拷贝数为0.007±0.015,≤55岁组为0.017±0.012,两组间差异有统计学意义(t=-2.586,P=0.022);有脉管癌栓组cbx7 mRNA的相对拷贝数为0.022±0.021,无癌栓组为0.006±0.011,两组间差异有统计学意义(t=-3.175,P=0.010).通过受试者特征曲线[ROC曲线,曲线下面积为0.769(P=0.033)]确定结肠癌患者cbx7 mRNA相对拷贝数的Cut-off值为0.002,小于0.002者确定为表达降低;cbx7低表达的结肠癌患者术后生存时间短,5年生存率仅为30.8%(4/13),而cbx7高表达患者5年生存率达77.8%(7/9),差异有统计学意义(χ2=4.329,P=0.037).在胃癌和肝癌患者中未见此现象.结论 在结肠癌、胃癌、肝癌组织中cbx7的表达明显下降;cbx7 mRNA的表达含量变化影响结肠癌患者预后.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between chromobox protein homolog 7 (cbx7) expression and the occurrence and development of colorectal carcinoma (CRC),gastric carcinoma (GC) and hepatocarcinoma (HCC) tissues.Methods The samples of neoplastic tissues and the corresponding cutting-edge normal tissues from 22 cases of CRC,20 cases of GC,30 cases of HCC were surgically collected.Level of cbx7 mRNA was detected with a fluorescent quantitative RT-PCR assay,and the correlationship among expression of cbx7 mRNA,the patients′ clinicopathologic features and the surviving time after surgery was analyzed.Results The relative copy number of cbx7 mRNA in carcinomas and the normal tissues was 0.010±0.015 vs 0.053±0.042 for CRCs,0.197±0.195 vs 1.891±1.254 for GCs,and 0.008±0.008 vs 0.030±0.021 for HCCs,respectively.Compared with the corresponding normal tissues,cbx7 expression was significantly downregulated in CRCs,GCs,and HCCs (t=-7.351,-5.417 and -6.680,respectively,P<0.01).The expression of cbx7 mRNA in CRCs had significant differences not only between two age groups (the relative copy number of cbx7 mRNA in age>55 group was 0.007±0.015,but 0.017±0.012 in age≤55 group,t=-2.586 ,P=0.022); but also between vascular embolus-positive and negative groups (the level of cbx7 mRNA in positive and negative group was 0.022±0.021 vs 0.006±0.011,t=-3.175,P=0.010).The area under the receiver operating characteristics(ROC) curve is 0.769 (P=0.033).when the Cut-off value of the relative copy number of cbx7 mRNA was 0.002 in CRCs.The values less-than 0.002 were defined as low expression.The CRC patients with low expression of cbx7 had a shorter overall survival time; whose 5 years survival rate was only 30.8%(4/13); while the rate was 77.8% (7/9) in high expression of cbx7 group.The difference had statistical significance (χ2=4.329,P=0.037).The similar differences could not be found among GC and HCC patients.Conclusion Downregulation of cbx7 expression was very common among multiple carcinomas cases,and the downregulation influenced the prognosis of CRC patients.     

人卵透明带蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人卵透明带蛋白(huZP3)基因原核表达载体。方法:利用PCR法扩增出含人卵透明带蛋白编码基因,先将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析,然后将huZP3蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pGEX4T-1上,酶切鉴定。结果:获得一个核苷酸长度约为1200bp的基因,同源比较结果表明,与GenBank(NCBI:M60504)公布的ZP3基因序列有100%的同源性。酶切表明ZP3基因正确插入原核表达载体pGEX4T-1。结论:成功构建出含ZP3基因的原核表达载体。     

人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品的构建

目的:构建用于检测人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品。方法:通过逆转录PCR扩增得到目的片段后连接至pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞。分别经PCR和测序验证重组质粒的正确性。分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作梯度稀释制得质粒标准品。10倍梯度稀释质粒标准品后进行实时荧光定量PCR分析。结果:人端粒酶催化亚基(hTERT)基因片段成功克隆至pMD18-T载体之中,重组质粒序列完全正确。实时荧光定量PCR分析10倍梯度稀释的质粒标准品所得标准曲线良好。结论:成功构建了人端粒酶催化亚基(hTERT)实时荧光定量PCR标准品。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs原核表达载体的构建与表达

摘要:目的　利用大肠杆菌原核表达系统表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV）NSs重组蛋白。方法　采用RT-PCR技术,从SFTSV毒株提取的病毒总RNA中,扩增NSs全长基因,将其克隆至pET22b（+）中构建原核表达载体pET22b-NSs,经酶切及测序鉴定后转化表达菌BL21（DE3）,IPTG诱导,通过Western Blot鉴定NSs蛋白的表达。结果　酶切、测序证明重组原核表达载体pET22b-NSs构建成功,免疫印迹法可见NSs基因编码蛋白表达。结论　实现了发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒NSs蛋白的结构与功能奠定了基础。     

直接酶联免疫吸附法和聚合酶链反应联合检测沙门菌的应用

目的　通过比较试验 ,得到准确、快速的沙门菌检测方法。方法　 2 2 8株沙门菌经过前增菌、选择性增菌后 ,采用在聚合酶链反应 (PCR)和酶联免疫吸附法 (ELISA)同时检测 ,并将 2种快速检测方法进行比较研究。结果　PCR法的敏感性优于直接ELISA法 ,2种方法的检测符合率达 99%以上。直接ELISA结合PCR法对饮食行业工作人员健康检查的 15 4 6份人粪便样品进行检测 ,同时以国家标准方法为参照 ,直接ELISA法的敏感性和特异性达 10 0 %和 97 14 % ,PCR法的敏感性和特异性均为 10 0 %。结论　优化的沙门菌检测程序是对大量样品采用直接ELISA筛检 ,除去大量阴性样品 ,阳性样品用PCR法作进一步鉴定 ;血清型的确定用国家标准方法。     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

人畸胎瘤衍化生长因子原核表达载体的构建及表达

目的:构建人畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)原核表达载体,进一步探讨其生物学作用及机制。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,利用TDGF-1特异性引物通过RT-PCR方法扩增TDGF-1 cDNA,克隆入pHB载体中,构建重组载体pHB-TDGF-1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并通过SDS-PAGE及免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达TDGF-1。结论:该研究成功构建了人TDGF-1原核表达载体,并能够在大肠杆菌中有效表达TDGF-1,为进一步研究TDGF-1的生物学功能及其机制奠定了基础。     

解脲脲支原体基因型的检测及其意义

目的 了解解脲脲支原体(Uu)基因分型情况,探讨其基因分型临床意义.方法 选择2010年8月-2011年2月在绍兴县中心医院门诊380例女性生殖道感染患者,以及同期无自觉症状的240例健康体检者,分别收集宫颈拭子标本,运用荧光定量PCR技术(RT-PCR)筛选出Uu阳性的初诊样本,设计分型引物,运用反向点杂交技术进行基因分型检测.结果 患者组Uu阳性270例,阳性率为71.05％,健康组阳性104例,阳性率为43.33％；患者组单纯U.parvum群感染率为63.77％,低于健康组的78.79％,差异有统计学意义(P＜0.05)；健康组中解脲脲支原体parvum群以其中的1、3、6基因型的单型别为主；患者组中Uu两群感染率较健康组高,差异有统计学意义(P＜0.05);患者组U.urealyticum群与1型的多型别感染率高于健康组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 U.parvum群,尤其是其中的1、3、6型别是正常人群携带的可能性较大,U.urealyticum则有可能和1型起协同作用或独自导致疾病.