人表皮细胞与无细胞异种真皮复合移植的实验研究

目的 观察人表皮细胞与无细胞异种真皮复合移植全层皮肤缺损创面后的效果,寻找一种新的创面覆盖物。方法 42只裸鼠作背部全层皮肤缺损创面,分别进行复合皮移植（复合皮组）和单纯表皮细胞膜片移植（对照组）,术后定期观察创面愈合情况并进行创面愈合率及创面收缩率的计算,同时留取创面组织进行组织学检查。结果 与对照组相比较,复合皮组的创面愈合及外观情况良好,两组创面愈合率及收缩率的差异有显性意义（P＜0．05）;组织学检测提示复合皮上皮分化充分,胶原增生有序,表皮－真皮连接结构重建明显,未见明显的急性期免疫排斥反应。结论 人表皮细胞与无细胞异种真皮复合移植能改善创面愈合质量,可作为一种新的皮肤代用品。     

含银异种脱细胞真皮基质的实验研究

目的了解含银异种脱细胞真皮基质(Xeno-ADM)的多项生物学性状,观察其移植效果。方法制备单纯xeno-ADM,再用2 g／L硝酸银浸泡,制成含银xeno-ADM。检测两种xeno-ADM对笔者单位烧伤患者创面常见菌的抑菌效果,并进行组织学观察;测量含银xeno-ADM的Ag+含量。在27只家兔背部制作全层皮肤缺损创面,分为A、B、C组,每组9只。A组移植自体刃厚皮,B组移植单纯xeno-ADM+自体刃厚皮,C组移植含银xeno-ADM+自体刃厚皮。术后2、4、6周取移植部位皮肤标本作形态学观察,并计算创面收缩率;术后2周计算移植皮片(未)成活率,并检测各组家兔淋巴细胞增殖活性。结果(1)含银xeno-ADM对创面常见菌的抑菌效果明显优于单纯xeno-ADM (P<0．05)。两种xeno-ADM中的表皮已完全除去,胶原纤维粗细均匀、排列规则、无明显变性,真皮中无细胞及细胞碎片。含银xeno-ADM的Ag+含量为(2．7±0．7)mg／g。(2)术后6周,A组家兔移植皮片呈暗红色,挛缩明显,易破溃,胶原纤维排列紊乱;B、C组移植皮片颜色接近周围正常皮肤,光滑无瘢痕,质地良好,胶原纤维排列有序,表皮-真皮连接结构和基底细胞桥粒、半桥粒结构以及基底膜重建明显。术后2、4、6周,A组家兔创面收缩率均明显高于B、C组(P<0．05);B、C两组创面收缩率相似(P>0．05)。术后2周,C组皮片完全成活率为91．7％,显著高于A组(77．8％)及B组(80．6％);3组家兔淋巴细胞增殖活性相似(P>0．05)。结论含银xeno-ADM脱除了基质中有免疫原性的细胞成分,保留了组织的基本结构和完整的胶原纤维支架,且具有较好的局部抗菌效果,不失为一种良好的真皮替代物。     

同基因细胞源组织工程皮肤修复皮肤缺损的实验研究

目的利用近交系大鼠实验模型评价同基因细胞源组织工程皮肤修复大鼠全层皮肤缺损的效果,为其临床应用奠定基础。方法取近交系F344大鼠乳鼠皮肤,采用Dispase-胰蛋白酶两步消化法分离培养表皮细胞;取SD大鼠皮肤,按照高渗盐-SDS-胰蛋白酶化学处理法制备脱细胞真皮基质;依次利用浸没式培养和气液分离培养法将第2代表皮细胞与脱细胞真皮基质复合体外培养构建组织工程皮肤。取4～5周龄近交系F344大鼠36只,于大鼠背部两侧对称制备全层皮肤缺损,缺损面积为预实验确定的1.5 cm×1.5 cm。将72个创面随机分为3组(n=24),两侧移植不同修复材料:实验组移植组织工程皮肤、阴性对照组移植同种异体脱细胞真皮基质、阳性对照组移植自体全层皮肤(非原位移植)。术后行大体观察、皮片成活率、创面收缩率测量及组织学观察,评价修复效果。结果实验组术后4周创面可达到Ⅰ期愈合,与周围组织紧密连接,外观接近周围正常皮肤。术后4周,阴性对照组皮片成活率为0;实验组为62.5%(15/24),与阳性对照组91.7%(22/24)比较差异有统计学意义(χ2=5.779,P=0.016)。术后4周,实验组和阳性对照组创面收缩率显著低于阴性对照组(P<0.05),实验组与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。组织学观察示实验组术后1周有轻微炎性反应;术后2周真皮层小血管和成纤维细胞大量增生,表皮层逐渐分化成熟;术后4周时伴随新生胶原纤维沉积,移植物真皮层出现胶原改建。结论同基因细胞源组织工程皮肤能够有效修复大鼠全层皮肤缺损,在防止创面收缩和促进创面愈合等方面均可达到类似于自体全层皮肤移植的效果。     

自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面中的作用研究

目的:探讨自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面的作用。方法:在20只大鼠身上分别取邮票大小自体全厚皮片进行消化,分离成单个表皮细胞的悬液;经传代培养后,使用自体表皮细胞悬液分别对20只大鼠背部表皮皮肤缺损创面进行覆盖移植,术后观察移植物成活率和植皮区收缩率,同时取移植物进行组织学观察;并与对照组20只自体愈合创面进行相互比较。结果:表皮细胞悬液移植后1周渐融合成片,伤口愈合;经6周后,伤口平整,轻度瘢痕愈合。而对照组在6周时伤口不平整,呈瘢痕愈合,色素沉着明显。结论:在表皮缺损创面上应用体外培养的自体表皮细胞悬液移植修复可达到重构皮肤的目的。     

体外构建复合皮移植后对大鼠创面愈合的影响

目的：观察角质形成细胞和成纤维细胞与无细胞异种真皮基质构成的复合皮移植于全层皮肤缺损创面后的效果,寻找一种新的创面覆盖物。方法：54只SD大鼠作背部全层皮肤缺损创面后分为A、B、C三组,分别以A型复合皮（角质形成细胞＋成纤维细胞＋无细胞异种真皮基质）、B型复合皮（角质形成细胞＋无细胞异种真皮基质）和普通敷料进行移植,术后定期观察创面愈合情况并进行创面收缩率的计算,同时切取创面组织进行组织学检测。结果：三组中,A组的创面愈合及外观情况最好;A组创面收缩率明显低于B、C两组（P（0．05）;组织学检测提示A组复合皮上皮分化充分,胶原增生有序,表皮一真皮连接结构重建明显,未见明显的急性期免疫排斥反应。结论：角质形成细胞和成纤维细胞与无细胞异种真皮基质构成的复合皮移植后能改善创面愈合质量,是一种较理想的、可探索的皮肤替代物。     

自体表皮细胞悬液促进大鼠Ⅲ度烧伤创面愈合效果研究

目的:探讨自体表皮细胞悬液促进Ⅲ度烧伤创面愈合的机制。方法:应用切削皮法结合胰蛋白酶技术获得自体表皮细胞悬液,皮下注射到Ⅲ度烧伤创面基底后观察大鼠Ⅲ度创面愈合率和创面愈合效果。结果:实验组自体表皮细胞悬液制作整个过程约1h内即可完成。实验组2和3周创面愈合率明显高于对照组(P0.01,P0.05)。实验组4周创面愈合后颜色和质地均明显优于对照组(P0.05)。结论:改进的自体表皮细胞悬液技术可操作性强,具有快速、简便、经济等优点,是治疗Ⅲ度烧伤创面的良好方法,其主要机制是表皮细胞去分化促进皮岛形成。     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究

目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于SD大鼠深度创面(实验组),对动物创面愈合情况进行观察.单纯脱细胞异种真皮替代物移植大鼠作为对照组.结果:构建的真核表达载体pcDNA31(+)-VEGF165可成功转染至鼠成纤维细胞,移植后实验组皮片成活率(9376±340)%,对照组皮片成活率(8501±174)%,两者差异有显著性(t=8873,P＜001).组织学观察显示,移植第4周实验组毛细血管数量明显多于对照组.结论:成功构建了经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,且其具有明显的促进动物创面愈合作用.     

异种脱细胞真皮基质与自体皮复合移植后基底膜重塑的实验观察

目的　观察异种 (猪 )脱细胞真皮基质与薄自体皮复合移植模型中基底膜重塑的变化规律。　方法　将异种 (猪 )脱细胞真皮基质与薄自体皮复合移植于大鼠创面 ,分别于移植后 1、2、3、4、8、12、16周留取标本 ,采用免疫组化、透射电镜等方法 ,观察基底膜中层粘连蛋白的变化规律及 12周时基底膜的超微结构 ,同时以单纯薄自体皮移植进行对照。　结果　异种脱细胞真皮基质与薄自体皮复合移植后 ,层粘连蛋白的表达高于单纯薄自体皮移植。 12周时复合移植组基底膜清晰连续 ,半桥粒较多且分布均匀 ;薄自体皮组基底膜致密板模糊、不连续 ,半桥粒减少且分布不均。　结论　异种脱细胞真皮基质与薄自体皮复合移植后 ,基底膜中层粘连蛋白表达增高 ,可能有利于复合皮移植后基底膜的重塑 ,增强表皮和真皮之间的连接 ,进而改善创面愈合质量     

自体表皮细胞-纤维蛋白膜创面移植治疗大鼠烧伤

目的：观察自体表皮细胞-纤维蛋白膜移植到大鼠烧伤创面治疗皮肤缺损的效果。方法：健康Wistar大鼠20只,随机分成烧伤皮肤缺损造模组和自体表皮细胞-纤维蛋白膜移植治疗组,治疗后计算表皮细胞在纤维蛋白膜上最佳接种密度,观察移植后的各组创面愈合情况、创面伤口的收缩比例等。结果：在纤维蛋白膜上接种表皮细胞的最佳密度为5×10^4／cm2,烧伤皮肤缺损造模组创面完全愈合时间平均22．3d,自体表皮细胞-纤维蛋白膜移植治疗组为18．1d,造模组创面收缩率为（70±5）％,移植组为（20±5）％（均P〈0．05）。结论：自体表皮细胞-纤维蛋白膜可用于覆盖大面积烧伤造成的皮肤缺损,预防创面伤口瘢痕化的形成,减轻创面收缩率,加速皮肤缺损创面的愈合速度。     

毛乳头细胞和表皮细胞构建带附属器的组织工程皮肤

目的根据毛囊形成原理,以人毛乳头细胞和表皮细胞为种子细胞,构建带附属器的组织工程皮肤替代物。方法分实验组和对照组,实验组皮肤替代物真皮层接种人毛乳头细胞和表皮细胞;对照组真皮层不接种任何细胞。在裸鼠背部作一圆形全层皮肤缺损,将两组皮肤替代物气-液界面培养5 d后移植到裸鼠背部。观察创面愈合情况,并在移植后第4、6、8周取材,进行组织学观察。结果皮肤替代物移植后2周,实验组创面已完全愈合,移植后4周对照组创面才完全愈合,并且对照组创面收缩比实验组明显。移植后6周,实验组真皮层内见到毛囊样结构和皮脂腺结构,对照组未见毛囊样结构和皮脂腺样结构。结论将人的毛乳头细胞和表皮细胞共同种植在皮肤替代物的真皮层,可以构建出带附属器的组织工程皮肤替代物,这种替代物对创面的修复能力更强。     

Wound healing effect of acellular artificial dermis containing extracellular matrix secreted by human skin fibroblasts

In this study, an acellular artificial dermis, composed of human collagen and glycosaminoglycan (GAG) secreted by cultured human fibroblasts on a bovine collagen sponge, was developed. Much of the newly secreted extracellular matrix (ECM) remained after the cell removal process. The main theme of this study focused on the matrix, rather than the viable cell components of the skin, as the major dermal deficit in the wound. Both the acellular artificial and bioartificial dermises, containing viable cells with ECM, were significantly less soluble than the collagen sponge, and the relative GAG content in the bioartificial and acellular artificial dermises was approximately 115-120% of the chondroitin-6-sulfate (CS) content found in the collagen sponge. In the group receiving the collagen sponge, the wound area gradually decreased to approximately 10% of its original area, while in the groups receiving the bioartificial and acellular artificial dermises, the wound area also gradually decreased to approximately 60 and 50%, respectively, of the original size over the 5 weeks after grafting. Both the bioartificial and acellular artificial dermises formed thicker, denser collagen fibers; more new blood vessel formation was observed in both cases. The basement membrane of the regenerated epidermal-dermal junction was thicker and more linear in the acellular artificial dermis graft than in the collagen sponge graft. In conclusion, the wound healing effects of acellular artificial dermis are no less than those of the bioartificial dermis, and much better than the collagen sponge graft with respect to wound contraction, angiogenesis, collagen formation, and basement membrane repair.     

Cultured keratinocytes in fibrin with decellularised dermis close porcine full-thickness wounds in a single step

The purpose of this study was to assess the feasibility of combined keratinocyte and dermal scaffold transplantation performed in a single step for treatment of full-thickness wounds. Cultured autologous keratinocytes were suspended in fibrin and grafted together with decellularised human dermis (Alloderm) in a porcine animal model, involving 10 animals over 4 weeks. Wound healing was evaluated by planimetry. Histology included morphological analysis as well as immunohistochemistry at regular intervals (1, 2 and 4 weeks). The results showed both successful histo-integration of the in vivo composite grafts and reduced wound contraction, compared with the control group (plain epithelial grafts). Histologically a neo-epithelium originated from the grafted cells on top of the decellularised dermis, as well as a reconstituted basement membrane. After 4 weeks cellular ingrowth into the dermal matrix could be observed. The successful combination of a keratinocyte-fibrin suspension and acellular dermis applied in a single step onto full-thickness wounds resulted in closure.     

去细胞异体真皮、去细胞猪真皮和自体刃厚皮移植在临床中的应用

目的观察去细胞异体真皮或去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植在深度烧伤和整形外科中的应用效果。方法采用去细胞异体真皮或我们研制的去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植的方法,修复各种创面119例次,比较不同创面的植皮成活率,观察应用不同部位的皮肤覆盖去细胞异体真皮或去细胞猪真皮与植皮成活的关系,并对部分病例进行了组织学观察和随访。结果削痂、切痂和切瘢创面植皮成活率分别为(93．4％±3．1)％、(92．1±4．6)％和(94．5±3．8)％,三者间差异无显著意义;去细胞异体真皮加自体刃厚皮移植与去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植,二者植皮成活率差异无显著意义。躯干、四肢自体刃厚皮覆盖的去细胞异体真皮或去细胞猪真皮,植皮成活率分别为(93．1±4．8)％、(89．0±6．2)％,而应用刃厚头皮或自体微粒皮加异体皮覆盖的去细胞异体真皮或去细胞猪真皮,植皮成活率明显下降(P<0．05或0．01)。组织学观察,术后19个月时表皮、真皮形态正常,胶原纤维排列规则,未见胶原纤维明显增生和瘢痕化,无皮肤附件。成活的复合移植皮肤,与邻近正常肤色近似,色素沉着轻,无明显皱缩,触之软,活动度好。结论去细胞异体真皮或去细胞猪真皮加自体刃厚皮移植修复深度烧伤创面或切瘢后创面不失为一种较理想的材料。     

激光微孔猪脱细胞真皮基质制备及创面移植的观察

目的 制备激光微孔猪脱细胞真皮基质（PADM），寻找其与自体刃厚皮复合移植的最佳孔间距。方法 采用胰蛋白酶法制备PADM，用激光加工机打孔，制备孔间距为0．8、1．0、1．2、1．5mm的激光微孔PADM。在144只SD大鼠背部制作全层皮肤缺损创面，分为微孔Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，依次采用前述4种孔间距的激光微孔 PADM＋自体刃厚皮移植；网状组采用网状PADM＋自体刃厚皮移植；对照组单纯移植自体刃厚皮。每组24只大鼠。观察移植后2、4、6周各组创面愈合情况，计算移植物成活率和创面收缩率，并行组织学观察。结果 移植后2、4周，微孔Ⅰ、Ⅱ组移植物成活率均低于对照组（P〈0．05），但与网状组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；移植后6周，微孔Ⅰ、Ⅱ组成活率明显高于网状组（P〈0．05）。移植后4、6周微孔Ⅰ、Ⅱ组创面收缩率较对照组显著降低（P〈0．05），移植后6周[（16．0±2．6）％、（15．1±2．4）％]明显低于网状组[（19．3±2．4）％，P〈0．05]。组织学观察见各微孔组上皮化良好，胶原纤维排列整齐，基底膜结构完整。结论 孔间距为0．8mm或1．0mm的激光微孔PADM与自体刃厚皮复合移植可提高创面修复质量，其中孔间距1．0mm效果最佳。     

真皮多能干细胞移植对大鼠光老化皮肤组织的修复作用

目的:进一步探讨真皮多能干细胞(dermal multipotential stem cells,DMSCs)移植对大鼠皮肤光老化(skin photoage)后组织修复作用的影响。方法:SD大鼠58只随机分为正常对照组(8只)、细胞移植组(25只)和PBS对照组(25只),细胞移植组和模型对照组采用UVA和UVB紫外灯同时进行照射制备皮肤光老化模型。体外分离培养DMSCs,吸取1ml细胞悬液(约1×106个)或等量PBS液分别于皮肤光老化区真皮层内多点注射移植,正常对照组不做任何处理。移植后4周、8周分别采用VG染色和Weigert染色观察皮肤全层胶原纤维、弹力纤维的表达变化;同时应用免疫组织化学染色观察各组大鼠皮肤真皮层vimentin的表达变化。结果:皮肤光老化损伤后,与对照组相比,DSMCs治疗组大鼠受损皮肤组织出现较多的新生胶原纤维和弹力纤维;DMSCs移植治疗组大鼠在真皮层内vimentin染色阳性的成纤维细胞的数量明显多于PBS对照组,移植后4周主要分布于真皮浅层,8周后广泛均匀弥散在皮肤各层。结论:DMSCs移植对大鼠光老化皮肤具有明显的促进组织修复的作用。     

以胶原海绵为载体培养的人表皮细胞移植

目的：将体外培养的人表皮细胞接种到胶原海绵上,构建一种表皮替代物,移植到鼠创面后研究观察皮肤的再生,方法：将手术切下的包皮经中性蛋白酶分离表皮,真皮,再经胰蛋白酶消化制成表皮细胞悬液,移入培养瓶中培养,将处于对数生长期的人表皮细胞直接接种到培养皿中的胶原海绵 ,再加上表皮细胞液培养3天后,移植到裸鼠全层皮肤缺损的创面上,以单纯无接种细胞的胶原海绵作为对照,并进行组织学,免疫组织化学及电子显微镜观察。结果：这种表皮替代物移植到创面后,表皮细胞继续增殖分化,形成一层新生表皮,与对照组相比,创面闭合早且收缩程度小,表皮成熟早且分层较多,基底膜形成较早,表皮下胶原纤维较少。结论：体外培养的表皮细胞能在胶原海绵上生长,移植到创面上后,该细胞可自动移行到创面并形成多层表皮结构,抑制创面收缩,可用于修复皮肤缺损。     

Culture of rat keratinocytes with acellular pig dermis.

This study evaluated the growth rate and the cell activity of cultured keratinocytes on acellular pig dermis in order to develop a composite skin in vitro for burn injuries or other skin defects. Full thickness skin was cultivated from neonatal SD rats, and separated into epidermal layer and dermal layer with enzyme digestion. The keratinocytes were then seeded on the prepared acellular pig dermis soaked in the culture medium. The cultures were incubated and the growth status of keratinocytes on acellular pig dermis evaluated by phase contrast microscope, histological examination with hematoxylin-eosin staining and acridine orange staining, immunohistochemistry, observation of growth curve plotted by MTT colorimetry and analysis of changes in keratinocytes proliferation cycle with flow cytometer. Almost all keratinocytes anchored in 48-72 h, and most inosculated at days 6 and 7. The growth curve showed that the keratinocytes grew in logarithmic phase at days 3-6 after seeding. More than four layers of keratinocyte structure and the basement membrane between keratinocytes and porcine dermis were observed. Pancytokeratin was strongly positive in the cultured keratinocytes. Laminin and collagen IV were positive in the basement membrane. It is concluded that the cultured keratinocytes on acellular pig dermis grow well and the structure of composite skin which has been established is satisfactory.