人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

IL-27亚基基因真核表达质粒的构建与表达

目的 克隆人白细胞介素27(interleukin 27,IL-27)蛋白亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-Barr vi-rus-induced gene 3,EBI3)与p28基因的cDNA,分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达.方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增EBl3与p28基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28.重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR检测目的 基因表达.结果 成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒,重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达.结论 人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建,为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础.     

空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的：构建空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒，并证实其能在COS-7细胞中表达。方法：以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应，获得空肠弯曲菌Pen：2、Pen：8、Pen：19和Pen：21cadF基因DNA片段。并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen：19PCR产物为目的基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，以构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF。重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞。运用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达。结果：双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功。采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。结论：空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF构建成功，并能在COS-7细胞中表达。为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础。     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

小鼠IL-33基因cDNA克隆与真核质粒的构建与表达

目的克隆小鼠IL-33基因（mIL-33）cDNA构建其真核表达质粒,并转染EL-4细胞检测其表达。方法提取小鼠脑与肺组织总RNA,经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建其真核表达载体pcDNA-mIL-33,重组质粒转染EL-4细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。结果 pcDNA-mIL-33中插入的DNA序列测定结果与mIL-33 cDNA序列一致,重组质粒转染EL-4细胞后检测到相应基因表达。结论成功克隆小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

重组CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44．5％。结论成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。     

MIG(CXCL9)表达载体构建及体外活性鉴定

目的构建MIG（CXCL9）真核表达载体,为利用MIG研究肿瘤基因治疗奠定基础。方法从pBLAST-MIG上切下含MIG全长的cDNA序列,定向插入pORF-mcs真核表达质粒,构建pORF-MIG重组质粒;然后经酶切分析和测序鉴定后,通过脂质体介导转染COS-7细胞;再进一步用免疫印迹法鉴定重组质粒的表达活性,用趋化试验鉴定生物学活性。结果pORF-MIG重组质粒经酶切分析和测序证实含有MIG的全长cDNA序列,转染COS-7细胞后高效表达MIG蛋白,对活化的淋巴细胞有趋化作用。结论成功构建了MIG（CXCL9）真核表达质粒,为进一步利用pORF-MIG研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。     

L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达.结果 扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带.结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达.     

真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165,并检测其在真核细胞内的表达。方法:将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay,经酶切鉴定及测序分析,脂质体介导法转染COS-7细胞,通过蛋白质印迹法检测其在COS-7细胞内的表达水平。结果:所构建的真核表达质粒pDisplay-hGI-TRaa1-165转染COS-7细胞后,在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论:成功表达pDisplay-hGITRaa1-165蛋白,为GITR的生物学功能研究奠定了基础。     

人连接蛋白Connexin26基因的克隆、表达及初步鉴定

目的研究含人连接蛋白Connexin26（Cx26）基因的真核表达载体构建及其在非洲猴肾细胞（COS-7）中获得稳定、高效表达的方法。方法提取人外周血淋巴细胞RNA,经逆转录制备成cDNA,设计特异性引物,用PCR方法从cDNA中扩增Cx26基因,将其定向插入真核表达载体pCI-neo中获得pCI-Cx26重组子-采用酶切法和测序法鉴定。用脂质体将pCI-Cx26转染COS-7细胞,经G418筛选,获得阳性克隆。用RT-PCR和SDS-PAGE检测对表达产物进行检测。结果从人外周血RNA制备而成的cDNA中可扩增出预期大小的Cx26基因片段,pCI-Cx26经双酶切测序证实构建成功。RT-PCR和SDS-PAGE检测到pCI-Cx26在COS-7细胞中获得稳定、高效表达。结论本研究成功构建了人连接蛋白Cx26基因重组真核表达载体pCI-Cx26：pCI-Cx26脂质体转染COS-7细胞,可见Cx26基因在COS-7细胞中获得稳定、高效的表达。该结果为今后进行pCI-Cx26基因治疗Cx26基因突变引起的遗传性耳聋的研究奠定了实验基础。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

Construction and identification of eukaryotic eukaryotic expression plasmid pcdna3.1-bace and its transient expression in cells

Objective： To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods： A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy：mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results： The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion： The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer＇s disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly.     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。     

绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2/pEGFP-N3 并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP-N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS-7细胞,RT-PCR和Western Blot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2-EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞48 h后,RT-PCR和Western Blot分析表明该融合基因能够在COS-7细胞中正确表达.结论: DDR2/pEGFP-N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.