三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较

目的 探讨补镁对高脂高糖膳食诱导大鼠肥胖模型形成的影响及作用机制.使用染胶法、染样品法及后染法比较溴化乙锭(FB)与3种新型核酸染料GoldViewna Ⅱ、GoldView及DNA Green染色DNA的灵敏度.方法 在琼脂糖凝胶电泳中,分别在3种染色方式下使用4种核酸染料对凝胶中的DNA进行染色,观察并分析电泳结果.结果 核酸染料比较结果:GoldViewna Ⅱ的灵敏度最高,DNA Green的灵敏度与EB相当,GoldView的灵敏度略低于EB.染色方式比较结果:使用染胶法的灵敏度最高,后染法次之,染样品法最低.结论 三种新型核酸染料完全可以替代EB,用于琼脂糖凝胶电泳DNA染色.使用新型核酸染料建议采用染胶法染色DNA.     

尿蛋白琼脂糖凝胶电泳及临床应用

1997年底我们引进了法国 Sebia公司的全自动电泳扫描系统 ,建立了尿蛋白琼脂糖凝胶电泳技术并应用于临床。现报告如下。1　仪器、试剂与方法1.1　 Hydrasys自动程控电泳系统 ,Hyrys光密度仪购自法国 Sebia公司 ;琼脂糖凝胶板、浓缩电泳缓冲液、考马斯亮蓝染液、样品预染液购自 Sebia公司 ;15 %醋酸脱色液、15 %甘油贮存液自配。1.2　方法1.2 .1　尿蛋白定量 :磺基水杨酸—硫酸钠浊度法。1.2 .2　尿蛋白电泳 :收集 2 4小时新鲜尿液 ,蛋白浓度控制在 2 g/ L以内 ,尿液经预染液预染后 ,加 5μl样品于凝胶片加样槽中 ,扩散 10 m in,将加样端…     

琼脂糖凝胶电泳法的探讨

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA或 RNA片段常用的方法。传统的琼脂糖凝胶电泳方法不但倒胶繁琐、费时 ,而且时有 DNA扩散等非特异现象。笔者为此进行改良并应用于 32种探针的鉴定和纯化 ,结果报告如下。1　材料与方法1.1　材料　标准分子量的 DNA及待测探针 32种。仪器 :稳压稳流电泳仪 (DYY 型 ,上海医用分析仪器厂 ) ;琼脂糖电泳仪 (FD2 0 1型 ,北京六一仪器厂 ) ;紫外线核酸检测仪 (2 DJ型 ,上海顾村电光仪器厂 )。试剂的配制见参考文献 [1,2 ]。1.2　方法　 (1)用胶带将电泳床两端开口封好 ,形成一模 ,水平放置台面 (用…     

PBR322:RSF1010重组质粒的构建

分别从大肠杆菌HB802(pBR322)及C600CRSF1010菌株中抽提质粒,用EcoRI酶切后,再用T_4DNA连接酶将它们连接,转化大肠杆菌C_(600)菌株,共获得253株转化子。经琼脂糖凝胶电泳及电镜摄影证实质粒PSMMI是pBR322:RSF1010重组体,可使宿主菌C_(600)获得对ApTc及Sm的抗性。本文对重组体pSMMI中pBR322和RSF1010的连接方向及这一重组质粒未能转化恶臭杆菌AC_(10)菌株的原因,进行了讨论。     

DNA的电泳行为

近年来核酸的结构及功能研究日趋深入,电泳技术是核酸研究不可缺少的工具之一。Thorme(1967)最先用琼脂糖凝胶电泳分离多瘤病毒 DNA,Elson 及 Jovin(1969)用聚丙烯酰胺凝胶分离寡核苷酸DNA。随后 Fisher 及 Dingman(1971)纯化了高分子量 DNA。目前电泳已广泛应用到核酸研究。依据支持物不同,可分为琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶或二者结     

Sebia-HYDRASYS电泳系统在血清蛋白电泳中的应用评价

目的 :探讨Sebia HYDRASYS电泳系统在血清蛋白电泳中的应用。方法 :采用法国Sebia$CHY DRASYS电泳系统进行血清蛋白琼脂糖凝胶电泳 ,利用pH(8.8± 0 .1)Tris巴比妥缓冲液作电泳缓冲液 ,血清蛋白质根据其所带电荷数将其分离成ALB、α1、α2 、β、γ球蛋白 ,已分离的蛋白质由氨基黑染色 ,多余染色在酸性介质中被洗去 ,被分离的着色的蛋白质通过光密度仪扫描获得各区较为精确的相对值 ,并与醋酸纤维薄膜电泳法相比较。结果 :琼脂糖凝胶电泳法批内精密度 (CV)为 0 .72 % (白蛋白 )至 4 .98% (α1-球蛋白 )之间 ,总精密度 (CV)为 2 .5 2 % (白蛋白 )至 6 .0 3% (γ球蛋白 )之间 ,较醋酸纤维薄膜电泳法显示较好的精密度 ,琼脂糖凝胶电泳还显示出独特的区带扫描特征。结论 :Sebia-HYDRASYS电泳系统可显示出独特的区带扫描特征 ,分辨率高 ,精密度好 ,简便快速等优点。     

Sebia-HYDRASYS电泳系统在血清蛋白电泳中的应用评价

目的:探讨Sebia-HYDRASYS电泳系统在血清蛋白电泳中的应用.方法:采用法国SebiaHYDRASYS电泳系统进行血清蛋白琼脂糖凝胶电泳,利用pH(8.8±0.1)Tris巴比妥缓冲液作电泳缓冲液,血清蛋白质根据其所带电荷数将其分离成ALB、α1、α2、β、γ球蛋白,已分离的蛋白质由氨基黑染色,多余染色在酸性介质中被洗去,被分离的着色的蛋白质通过光密度仪扫描获得各区较为精确的相对值,并与醋酸纤维薄膜电泳法相比较.结果:琼脂糖凝胶电泳法批内精密度(CV)为0.72%(白蛋白)至4.98%(α1-球蛋白)之间,总精密度(CV)为2.52%(白蛋白)至6.03%(γ球蛋白)之间,较醋酸纤维薄膜电泳法显示较好的精密度,琼脂糖凝胶电泳还显示出独特的区带扫描特征.结论:Sebia-HYDRASYS电泳系统可显示出独特的区带扫描特征,分辨率高,精密度好,简便快速等优点.     

琼脂糖凝胶区带电泳应用于蛋白尿的分析

目的：运用琼脂糖凝胶区带电泳进行蛋白尿的分析。方法：采用血清琼脂糖凝胶区带电泳技术分析未经处理和处理后的蛋白尿样本。结果：通过对95例临床尿蛋白阳性标本进行琼脂糖凝胶区带电泳，可粗略区分出溢出性蛋白尿2例、选择性蛋白尿30例、非选择性蛋白尿63例，5例健康组未检出蛋白峰。结论：该法简便快速，在蛋白浓度较高时有很好的重复性，可用于尿蛋白的分析，经透析浓缩处理后的样本电泳效果更好。     

不同RT-PCR方法学的探讨

目的:探讨微量RNA标本的RT-PCR方法。方法:采集13例新生大鼠脊髓标本,提取RNA,分别稀释至1μg/μl、1ng/μl和1 pg/μl,分别以两步法RT-PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒,扩增β-actin基因,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察分析。结果:浓度为1μg/μl和1ng/μl的标本,三种方法均出现了目标带,而浓度为1 pg/μl的标本,两步法RT- PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒的阳性率分别为85%、77%和100%。结论:一步法敏感性高于两步法,微量RNA标本以采用Qiagen公司的一步法试剂盒进行RT-PCR实验为好。     

琼脂糖凝胶厚度对DNA电泳的影响

目的 研究不同厚度的琼脂糖凝胶对电泳的影响。方法 用扩增得到的产物进行不同厚度的琼脂糖凝胶电泳．溴化已锭染色成像并求出进行相对迁移率等相关分析。结果迁移距离5～7m厚度凝胶时最大；10mm以内相对迁移率随着凝胶厚度的增加而增大，10mm以上相对迁移率反而降低；电泳图像以3～10mm较好。结论 5～7mm厚度的琼脂糖凝胶进行电泳较合适。     

DNA检测中琼脂糖凝胶重复使用效果

目的：摸索在DNA检测中琼脂糖凝胶多次重复使用的效果。方法：按常规制备琼脂糖凝胶,胶不离框,上样、电泳,电泳后胶连框一起放于饭盒内,盖好盒盖,于4℃冰箱保存。下次使用时保证电泳方向与前次相反,即把胶调转方向加样、电泳。结果：重复使用6~7次,DNA条带仍清晰可见。结论：这是一种简便易行、效率高、节省实验经费并易于推广的好方法。     

灵敏准确的甲胎蛋白定量新方法—酶联火箭电泳测定法

本研究创立一种灵敏、准确的甲胎蛋白定量方法酶联火箭电泳测定法。此法是将辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋白抗体混合于琼脂糖凝胶中进行火箭电泳,免疫沉淀线具有酶活性,经与 H_2O_2和3-氨基-9-乙基卡巴唑保温,借酶促反应使沉淀线出现强烈的有色沉淀而被清楚显示出来。这种新方法可对甲胎蛋白作出灵敏、快速而精确的定量。本法甲胎蛋白定量的下限为5～10ng/ml,灵敏度比火箭电泳法高100倍,比放射火箭电泳法高2～5倍。其甲胎蛋白测定范围为10～3000ng/ml,宽于放射火箭电泳法(25～800ng/ml)和放射免疫测定法(RIA)(0～400ng/ml)。本法准确度与RIA 一致。组内变异系数为2.4%,组间变异系数为3.1%,而 RIA 法为17.4%。     

Survivin反义核酸增强PANC-1细胞对阿霉素的敏感性

目的:探讨surv iv in反义核酸对阿霉素诱导胰腺癌细胞系PANC-1细胞凋亡的影响。方法:将已构建成功的surv iv in反义核酸真核表达载体pcDNA 3-SVV as电转染胰腺癌细胞系PANC-1,并筛选转染成功的阳性克隆;台盼蓝拒染法观察surv iv in反义核酸与阿霉素联合应用对PANC-1细胞生存的影响;细胞计数和M TT试验测定转染细胞对阿霉素敏感性;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡DNA断裂情况。结果:转染surv iv in反义核酸的PANC-1/SVV as细胞增殖明显受抑,与PANC-1/neo细胞、PANC-1细胞进行比较,具有显著性差异(P<0.05);M TT实验显示,阿霉素对PANC-1/SVV as、PANC-1/neo、PANC-1细胞的IC50值分别为0.285±0.012μm o l/L、1.528±0.317μm o l/L和1.540±0.253μm o l/L。统计分析证明差异具有显著性(P<0.01);经琼脂糖凝胶电泳,PANC-1/SVV as细胞可见到DNA梯形条带,而PANC-1/neo、PANC-1细胞未见到。结论:surv iv in反义核酸可促进阿霉素诱导PANC-1细胞凋亡,为胰腺癌的基因治疗研究提供了实验依据。     

集成毛细管电泳芯片分离尿蛋白条件的初步优化

目的:探讨集成毛细管电泳芯片快速分离尿蛋白条件的初步优化。方法:考察了分离电压(1200～2000V)、进样时间(10～30s)及乙胺浓度(0.5～2%(v/v))对尿蛋白分离的影响。结果:以75mmol/L pH10.3硼酸盐缓冲液含9.73μmol/L乳酸钙、1%(v/v)乙胺为电泳缓冲液,在以500V的进样电压进样15s、分离电压1500V条件下,电泳分离尿蛋白能分出更多蛋白峰。结论:通过优化可以有效地提高电泳芯片分离尿蛋白的效果。     

不同酶切体系对胶回收纯化DNA浓度的影响

目的 通过建立不同的酶切体系,找寻酶切效果好、胶回收试剂盒纯化DNA得率高的实验设计.方法 使用XhoⅠ单酶切重组质粒pcDNA3-P2X4,酶切体系的体积分别为:150μl、160μl、170μl、180μl;酶切体系组成为:dddH2O(补足体积)、Buffer R(应用浓度是酶切体积的10%)、质粒DNA(无论所得质粒浓度如何,琼脂糖凝胶电泳胶回收的DNA上样量统一为23μg),XhoⅠ10μl(6μl、4μl两次加入);反应温度为:37℃ ;酶切的时间为2～3h.结果 酶切体系越大,所需要的酶切时间越短、酶切效果越好、酶切条带越接近Marker标准条带(通过电泳拍照观察所得),但是胶回收纯化后DNA的浓度却越低:150μl体系 DNA的浓度=308.96±8.71μg/ml,160μl体系 DNA的浓度=286.62±8.37μg/ml,170μl 体系DNA的浓度=245.80±15 64μg/ml,180μl体系 DNA的浓度=198.00±16.54μg/ml(方差分析,P<0.05,n=5).结论 将酶切的体系放大,杂质将相对稀释,不需增加酶的用量就能取得较好的酶切效果;提取质粒的浓度和纯度也决定着酶切效果.     

人乳头瘤病毒11型的DNA分子克隆

以E coli C300为受体菌,利用人乳头瘤病毒11型DNA与pBR322的重组质粒(pBR322-HPV11DNA),成功地进行了HPV11DNA的转化,经筛选获得61株重组子,随机对15株转化子以碱变性法及清亮裂解法抽提了pBR322-HPV11DNA的重组质粒,纯化后经BamHI酶切及琼脂糖凝胶电泳,以λDNA/HindⅢ作参考分子量测定,初步结果证实存在有分子量为5.5×10~6(约8.1kb)的HPV11DNA。这为HPV11DNA的分子扩增,基因探针的制备及HPV11型量鳞癌的研究提供了方便。     

复方壳多糖组织工程皮肤活力测定的研究

目的介绍一种快捷、简便、灵敏和准确的测定组织工程皮肤活力的方法。方法采用SYTO 13和溴化乙锭(ethid-ium bromide,EB)2种荧光核酸染色剂对冻存后组织工程皮肤进行染色,通过流式细胞计数仪及荧光显微镜下观察等方法计算活细胞。结果4℃条件下,组织工程皮肤冻存7d后表皮活力值为未冻存时的62.46%;冻存7d后真皮活力值为未冻存时的54.21%。结论SYTO/EB双重核酸染色法是测定组织工程皮肤活力的既简便又准确的方法。     

DNA聚合酶含量对目的基因扩增的影响

目的:探讨DNA聚合酶在PCR技术检测目的基因时的最佳作用浓度及DNA聚合酶浓度对目的基因片断扩增结果的影响。方法:其他反应条件不变的前提下,分别固定Taq DNA聚合酶含量和Mg2+浓度进行PCR反应,然后通过琼脂糖凝胶电泳检测得出二者最佳作用浓度。结果:在50μl的PCR反应体系中,用0.5μl的Taq DNA聚合酶(5u/μl)和2μl的25mM MgCl2进行PCR反应时,目的基因扩增产物质量相对完好,电泳检测条带清晰规整。结论:DNA聚合酶含量对目的基因片断的扩增结果影响巨大。     

全自动毛细管电泳与琼脂糖电泳检测血红蛋白的比较

目的 比较全自动毛细管电泳与琼脂糖电泳的血红蛋白电泳检测结果 ,探讨全自动毛细管电泳仪在地贫筛查中的价值.方法 使用法国Sebia公司Capillarys 2全自动毛细血管电泳仪及配套试剂,在9.8 kV电压、pH 9.4的缓冲液条件下,在8条并联的石英毛细管内进行血红蛋白电泳,用415 nm波长直接检测血红蛋白各组分的百分比;毛细管电泳发现的异常标本同时采用Sebia Hydrasys LC琼脂糖凝胶电泳系统进行电泳、染色、脱色、烘干,用Hyrys扫描系统扫描,得出血红蛋白各组分的百分比,与毛细管电泳检测结果 进行对比.结果 在2 400份临床标本中.Capillarys 2全自动毛细管电泳仪共检出β地贫262例,其中HbA2增高161例,HbF增高28例,HbA2+HbF同时增高73例;用Hydrasys LC琼脂糖凝胶电泳系统对262例异常标本进行复检对照,结果 基本一致;仅在HbF≤3.0%时,琼脂糖凝胶电泳无法将其与HbA区分,而毛细管电泳可以准确分辨.α地贫筛查中,Capifiarys 2全自动毛细管电泳仪共检出HbH 13例、HbBart's 1例、HbCS 3例:而琼脂糖凝胶电泳系统仅检出HbH10例、HbBart's 1例、HbCS 1例,漏检HbH 3例、HbCS 2例.结论 全自动毛细管电泳能比琼脂糖电泳更准确区分HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBart's、HbCS等条带,对地贫筛查效果更佳.     

RAPD的建立及优化研究

目的：建立优化的RAPD反应条件,为进一步进行遗传监控研究奠定基础。方法：按常规方法制备小鼠基因组DNA,在一定的RAPD－PCR反应条件下分别改变各组份浓度及退火温度。扩增产物在含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射仪上观察照相。结果：当Mg^2 浓度为1．5mmol/L,4种dNTPs各为150μmol/L,Taq酶为1．5U,引物为0．2mol/L,模板DNA为50ng,退火温度为38℃,RAPD－PCR扩增效果好。结论：在优化的条件下规范操作,RAPD的稳定性、重复性好。