Akt基因在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义

目的:检测Akt基因在正常卵巢组织、上皮性卵巢囊肿、交界性上皮性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织中的表达水平,探讨其在上皮性卵巢癌演变过程中的作用及临床意义。方法:收集正常卵巢组织10例、良性上皮性卵巢囊肿组织15例、交界性上皮性卵巢肿瘤组织15例和上皮性卵巢癌组织40例。RT-PCR和Western blot法分别检测Akt mRNA和蛋白的表达水平,并分析其与临床病理特征的相关性。采用Akt激酶特异性抑制剂Triciribine分别作用于上皮性卵巢癌SKOV3、ES-2细胞,MTT法和FCM分别检测细胞增殖和凋亡,比较单独抑制剂Triciribine、单独顺铂及联合两种制剂的治疗方案对SKOV3、ES-2细胞的作用。结果:(1)Akt1、Akt2、Akt3 mRNA及p-Akt在正常卵巢组织、上皮性卵巢囊肿、交界性上皮性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织中均有表达,上皮性卵巢癌组织中的表达水平显著高于其余3组(P0.05);(2)p-Akt表达水平、总Akt mRNA水平与上皮性卵巢癌的临床分期和组织分级有关(P0.05),而与患者年龄和病理类型无关(P0.05);(3)Triciribine能有效抑制SKOV3、ES-2细胞中p-Akt水平,呈浓度依赖性抑制癌细胞生长率,联合顺铂处理可增加癌细胞的凋亡率。结论:Akt在上皮性卵巢癌组织过度激活,与临床分期和组织分级相关。Akt异常激活不仅是上游PI3K异常激活的后续效应,同时与Akt自身扩增密切相关。Triciribine阻断Akt的信号传导可增强顺铂化疗的疗效。     

WWOX基因干扰对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响

目的 研究应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞中WWOX基因的表达,并探讨WWOX基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系.方法 将设计合成的针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体瞬时转染法将其转染进WWOX基因高表达的卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/SB细胞中,用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别测定转染前后SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna及蛋白表达的变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测转染前后SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数;应用流式细胞仪检测转染前后SKOV3/SB细胞的生长周期,高效液相色谱仪测定转染前后SKOV3/SB细胞中顺铂的药物浓度.实验分为5组:(1)SKOV3组:接种SKOV3细胞;(2)SKOV3/SB组:接种SKOV3/SB细胞;(3)SKOV3/SB阴性对照转染组:接种转染阴性对照序列的SKOV3/SB细胞;(4)SKOV3/SB脂质体转染组:接种转染脂质体的SKOV3/SB细胞;(5)SKOV3/SB siRNA转染组:接种转染siRNA的SKOV3/SB细胞.结果 转染48 h后,SKOV3、SKOV3/SB、SKOV3/SB阴性对照转染、SKOV3/SB脂质体转染、SKOV3/SB siRNA转染组细胞中WWOX Mrna的表达水平分别为0.647±0.025、2.239±0.030、2.392±0.041、2.379±0.047、1.219±0.032,WWOX蛋白的表达水平分别为1.368±0.028、1.639±0.031、1.580±0.025、1.552±0.034、0.653±0.017,SKOV3/SB siRNA转染组与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).转染siRNA前、后,SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数由5.04降至3.89;细胞周期中G1期由39.2%增至45.6%,S期由50.4%降至37.5%;耐药细胞内顺铂浓度由9.43 ns/L升至23.45 w/L,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 针对WWOX基因合成的特异性siRNA能明显抑制SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna和蛋白的表达,并能在一定程度上恢复其对顺铂的敏感性,推测WWOX基因可能参与了卵巢癌细胞的顺铂耐药过程.     

GOLPH3通过PI3K/Akt信号通路调控上皮性卵巢癌细胞增殖与凋亡的研究

目的:探讨GOLPH3基因对上皮性卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响及作用机制。方法:siRNA干扰技术沉默SKOV3细胞株中GOLPH3基因表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测PI3K/Akt信号通路相关基因Akt、p-Akt 473、p-Akt 308及Bcl-2表达。PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理卵巢癌SKOV3细胞后,检测SKOV3细胞的增殖能力及凋亡情况。结果:siRNA干扰SKOV3细胞株中GOLPH3基因,GOLPH3表达下调,细胞增殖减少,凋亡增多;PI3K/Akt信号通路相关基因p-Akt 473、p-Akt 308、抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平均下降,Akt蛋白水平表达无显著变化。LY294002处理SKOV3细胞后,细胞增殖率降低,凋亡率升高。结论:GOLPH3基因可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进卵巢癌细胞增殖,并抑制其凋亡的作用。     

米非司酮对卵巢上皮性癌耐药细胞DNA修复基因表达和顺铂敏感性的影响

目的 研究米非司酮对卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞DNA修复基因表达的调控,及对顺铂的增敏作用.方法 应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮作用后卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的顺铂半数抑制浓度(IC50);用RT-PCR技术、流式细胞仪检测米非司酮联合顺铂作用后COC1/DDP细胞ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA的表达水平及细胞周期和凋亡率的变化;建立COC1/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为顺铂组、米非司酮组、联合组和对照组,观察米非司酮在裸鼠体内对顺铂的增敏作用.结果 2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮分别使COC1/DDP细胞对顺铂的IC50下降为(3.18±0.46)、(1.95±0.14)和(0.64±0.18)μg/ml,2.5 μmol/L米非司酮联合顺铂作用后的IC50与单用顺铂者[(3.71±0.38)μg/ml]比较,差异无统计学意义(P=0.076),其他浓度之间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).米非司酮下调ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA表达水平,3种基因mRNA的相对表达量随米非司酮浓度的升高均呈下降趋势.2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮联合顺铂对COC1/DDP细胞作用后,G0/G1,期细胞比例升高(分别为51.68%、53.74%、55.08%).2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮与10 μg/ml顺铂联合作用使细胞凋亡率分别增加为5.11%、9.13%和12.24%.米非司酮联合顺铂治疗裸鼠皮下移植瘤的生长抑制率为70.1%,与顺铂组、米非司酮组(分别为22.5%、6.5%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 米非司酮通过下调ERCC1、BRCA1、hMLH1基因的表达及阻滞G0/G1期细胞、增加细胞凋亡率来增强顺铂对卵巢癌细胞的抗肿瘤敏感性.     

survivin基因修饰后对卵巢上皮性癌HO-8910细胞周期及化疗敏感性的影响

目的 探讨survivin基因经不同方式基因修饰后对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞系HO-8910细胞周期和化疗敏感性的影响.方法 对survivin基因进行两种方式的基因修饰,即survivin基因核苷酸序列第34位苏氨酸突变为丙氨酸(T34A)和N末端缺失8个氨基酸(N-8AA),构建含survivinN-8AA和survivinT34A基因的表达载体,将含survivinN-8AA、survivinT34A和野生型survivin基因的表达载体转染HO-8910细胞(分别为SN-HO-8910组、M-HO-8910组和Sur-HO-8910组),以转染空载体pcDNA3.1质粒(PC-HO-8910组)为对照.(1)采用逆转录(RT)PCR技术检测和测序法鉴定转染后HO-8910细胞各目的 基因mRNA的表达;(2)采用流式细胞仪检测各组转染后HO-8910细胞的细胞周期比例;(3)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组转染后HO-8910细胞对顺铂、紫杉醇和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂--LY294002的敏感性[以50%抑制浓度(IC50)表示].结果 (1)RT-PCR技术检测和测序法鉴定结果显示,转染后的HO-8910细胞分别稳定表达survivinT34A、survivinN-8AA和野生型survivin mRNA.(2)SN-HO-8910组细胞G0/G1期比例为44.72%,明显低于PC-HO-8910组的49.64%(P＜0.05);而G2/M期和S期比例(分别为1.06%和54.22%)明显高于PC-HO-8910组(分别为0.56%和49.80%;P＜0.05).M-HO-8910组细胞G2/M期和S期比例分别为0.16%和36.33%,明显低于PC-HO-8910组(P＜0.05);而G0/G1期比例(63.51%)明显高于PC-HO-8910组(P＜0.05).Sur-HO-8910组G0/G1期、G2/M期和S期比例分别为54.46%、0.62%、44.92%,分别与PC-HO-8910组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).(3)Sur-HO-8910组细胞对顺铂和紫杉醇的IC50[分别为(20.4±6.1)和(36.7±4.0)μmol/L]均明显高于PC-HO-8910组[分别为(14.4±3.9)和(28.6±3.6)μmol/L;P＜0.05].SN-HO-8910组细胞对顺铂和LY294002的IC50[分别为(7.6±1.0)和(13.2±4.0)μmol/L]均明显低于PC-HO-8910组[分别为(14.4±3.9)和(41.0±7.9)μmol/L;P＜0.01],而对紫杉醇的IC50[(37.9±4.8)μmol/L]明显高于PC-HO-8910组(P＜0.05).M-HO-8910组细胞对顺铂的IC50[(9.9±1.2)μmol/L]明显低于PC-HO-8910组(P＜0.05),而对LY294002的IC50[(66.9±4.8)μmol/L]明显高于PC-HO-8910组(P＜0.01).结论 survivin基因行缺失N-8AA和突变T34A修饰后,使细胞周期分别向G2/M期、S期及G0/G1期移行.survivinN-8AA比survivinT34A更为显著地介导了顺铂和LY294002诱导的细胞毒作用,提示这可能与survivin基因功能的细胞周期依赖性以及不能形成活性二聚体有关.     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂联合顺铂对卵巢上皮性癌细胞体外抑制作用的研究

卵巢上皮性癌（卵巢癌）的死亡率居妇科恶性肿瘤的首位，但目前对其分子病因学却知之甚少。由于卵巢癌长期隐匿在腹腔内，早期诊断困难，多数患者诊断时已为晚期，除用顺铂、紫杉醇等少数化疗药物可稍延长患者存活时间外，这些晚期、复发性卵巢癌患者的生存率和预后在近40年几乎无变化，明显低于其他妇科恶性肿瘤患者。近年来研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）在多种人类恶性肿瘤组织中表达水平异常增高，PI3K催化亚单位P110α（PDKCA）在80％原发性卵巢癌细胞内mRNA拷贝数增加约40％。在癌细胞内，P13K通过磷脂酰肌醇依赖性激酶（PDK1）、蛋白激酶B（PKB）形成P13K／PDK1／PKB信号通道，抑制细胞凋亡，刺激细胞增殖。顺铂是治疗卵巢癌的主要化疗药物，本研究观察了P13K抑制剂——LY294002及其联合顺铂对卵巢癌细胞株H08910PM和OVCAR3细胞生长的抑制作用，以期为中晚期卵巢癌的临床治疗提供理论依据。     

白细胞介素6诱导卵巢上皮性癌细胞对化疗药物产生耐药的机制研究

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)诱导卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞对化疗药物产生耐药的机制及相关信号传导通路.方法 应用外源性重组IL-6短期处理或将正义IL-6基因(ssIL-6)稳定转染至A2780细胞(不表达IL-6但表达其受体、对顺铂和紫杉醇敏感),同时将反义IL-6基因(asIL-6)稳定转染至SKOV3细胞(高表达IL-6及其受体、对顺铂和紫杉醇耐药),应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、逆转录PCR(RT-PCR)技术及蛋白印迹法(western blot)观察IL-6是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对可能的信号传导通路进行研究.结果 (1)外源性重组IL-6处理A2780细胞后,对顺铂和紫杉醇的耐药倍数分别为6.25和7.31倍;ssIL-6转染A2780细胞后(内源性过表达IL-6),IL-6低、中、高表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为7.13、7.47和8.34倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为7.61、8.27和10.70倍;而asIL-6转染SKOV3细胞后(抑制内源性IL-6表达),IL-6中、高抑制表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为0.15和0.10倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为0.10和0.08倍,可恢复SKOV3细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性.(2)外源性IL-6作用后,上调了A2780细胞中耐药相关基因MDR1和GST-π以及凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL和XIAP mRNA和蛋白的表达;与此相一致,ssIL-6转染的A2780细胞中MDR1、GST-π及bcl-2、bcl-xL、XIAP mRNA和蛋白的表达水平增加,而asIL-6转染的SKOV3细胞则明显降低.(3)有丝分裂原活化的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂--PD98059和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂--wortmannin能分别阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)的活化作用,且两者均能阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生的耐药,细胞生长明显减少.结论 IL-6诱导的卵巢癌细胞化疗耐药很可能与其上调卵巢癌细胞耐药相关基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL、XIAP的表达以及活化MEK/ERK和PI3K/Akt信号传导通路有关.     

微小RNA-16逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)在人上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达及其与顺铂耐药的关系。方法:脂质体lipofectamine2000介导miR-16成熟体模拟物(mimics)及阴性对照片段(NC)分别转染人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP。实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-16的表达;蛋白印迹法检测细胞中Bcl-2蛋白、c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50);caspase-3活性检测试剂盒检测细胞内caspase-3酶的活性;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:(1)SKOV3/DDP细胞顺铂耐药指数(RI)为5.33;(2)SKOV3/DDP细胞中miR-16表达水平明显低于SKOV3细胞,约为后者的1/10(P=0.000),转染miR-16 mimics后SKOV3/DDP细胞中miR-16水平升高约660倍(P=0.001);(3)SKOV3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量较SKOV3细胞明显升高,转染miR-16 mimics后SKOV3/DDP细胞Bcl-2、c-myc蛋白的相对表达量明显降低(P<0.01);(4)SKOV3/DDP细胞转染miR-16 mim-ics后,顺铂IC50(14.19±0.06)较转染NC组(22.52±0.60)明显降低(P=0.002),且顺铂作用后caspase-3的酶活力单位也明显升高(P=0.000);(5)顺铂(20μg/ml)作用24h、48h后,SKOV3组凋亡率明显高于SKOV3/DDP组,转染miR-16 mimics的SKOV3/DDP细胞凋亡率约为转染NC细胞的1.5倍(P<0.01)。结论:miR-16可能通过靶向下调上皮性卵巢癌细胞Bcl-2蛋白,并协同调节c-myc蛋白的表达,增强卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性,发挥逆转耐药的作用。     

Survivin、caspase-3及PCNA在卵巢上皮性肿瘤中表达的临床意义

目的 探讨凋亡调控因子Survivin、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及细胞增殖标记指数(PCNA)在卵巢上皮性肿瘤中表达的临床意义.方法 采用免疫组织化学技术,检测2006年1月至2006年12月哈尔滨医科大学第一临床医学院收治的40例卵巢上皮性癌、10例交界性卵巢上皮性肿瘤组织及10例卵巢良性上皮性肿瘤中Survivin、caspase-3和PCNA的蛋白表达,并结合临床病理特征进行分析.结果 Survivin、caspase-3在卵巢上皮性肿瘤中表达呈负相关;Survivin和PCNA的蛋白表达呈正相关;Survivin在卵巢上皮性癌中表达率72.5%(29/40),且表达水平高于卵巢良性上皮性肿瘤(0)和交界性卵巢上皮性肿瘤(40%)(P＜0.05).caspase-3在卵巢上皮性癌中表达率0.5%(2/40),且表达水平远远低于卵巢良性上皮性肿瘤和交界性卵巢上皮性肿瘤(P＜0.01).结论 Survivin可能抑制caspase-3在卵巢癌中表达,导致卵巢癌细胞增殖,凋亡受阻,肿瘤形成;Survivin基因的表达可能发生在卵巢癌恶性转化的早期;Survivin的表达与瘤细胞分化、增殖密切相关,并且其高表达可能会作为预后不良的标志;caspase-3在卵巢癌中极低表达,有望成为卵巢癌良恶鉴别新的指标.     

SDF-1对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力作用的相关通路研究

目的:探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002、MEK通路抑制剂PD98059对基质衍生因子-1(SDF-1)作用下卵巢癌细胞SKOV3的增殖、侵袭能力的影响,初步探讨SDF-1在卵巢癌中的相关作用通路。方法:细胞免疫化学法检测SDF-1不同作用时间及不同作用浓度对卵巢癌细胞中磷酸化Akt(p-Akt)和ERK(p-ERK)表达的影响。选取对数生长期细胞,分别加SDF-1 100ng/ml、CXCR4中和抗体10μg/ml、CXCR4抑制剂AMD3100 1μg/ml、LY294002 50μmol/L、PD98059 50μmol/L。MTT、Transwell细胞侵袭实验检测细胞的增殖、侵袭能力的变化。结果:随着SDF-1作用时间的延长,p-Akt、p-ERK蛋白表达水平增高;Akt、ERK蛋白的最佳活化时间为30min。作用30min时,随着SDF-1作用浓度的增加,p-ERK1、p-Akt蛋白表达水平增高,差异具有统计学意义(P0.05)。SDF-1可明显促进SKOV3细胞的增殖、侵袭能力(P0.05);但加入CXCR4中和抗体、CXCR4抑制剂AMD3100、通路抑制剂PD98059、LY294002后,SKOV3细胞的增殖、侵袭能力无明显变化(P0.05)。结论:SDF-1对卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭能力的增强作用可被PI3K/Akt信号通路抑制剂、MEK通路抑制剂所阻断。SDF-1可能通过Ras/ERK信号转导通路、PI3K/Akt信号通路发挥作用。     

Aberration of the PI3K/AKT/mTOR signaling in epithelial ovarian cancer and its implication in cisplatin-based chemotherapy

Objective

This study was to investigate the role of the PI3K/AKT/mTOR signaling in epithelial ovarian cancer development and its mechanism in cisplatin-based chemotherapy.

Study design

Western blot and RT-PCR were used to determine the expression of PI3K-p85 subunit at protein and mRNA levels in normal and cancerous ovarian epithelium. SKOV3/DDP cells and SKOV3/MCA (multicellular aggregates) were constructed as chemo-resistant models. The role and mechanism of AKT specific inhibitor or shRNA in different models before and after cisplatin treatment were determined by multiple cellular and molecular approaches such as cell growth assay, flow cytometry, and western blot.

Results

PI3K-p85 subunit was detected in 33 out of 39 epithelial ovarian cancer specimens at protein level, but not detected in normal ovarian epithelium. A significant over-expression of PI3K-p85 subunit at mRNA level was observed in tumor tissues, and an increasing trend in advanced stage was also observed. Elevated activation of the AKT/mTOR/Survivin signaling was detected in SKOV3/DDP cells and SKOV3/MCA. Down-regulation of AKT by triciribine or shRNA transfection could attenuate cisplatin resistance through mTOR/Survivin signaling.

Conclusions

The PI3K/AKT/mTOR signaling was involved in epithelial ovarian cancer development and cisplatin-based chemotherapy, and down-regulation of AKT could be an effective adjuvant antitumor therapy.     

Downregulation of miR-503 contributes to the development of drug resistance in ovarian cancer by targeting PI3K p85

Objective

Cisplatin is an important chemotherapeutic agent frequently used in the treatment of ovarian cancer. However, resistance to cisplatin is an obstacle to the treatment of ovarian cancer. Recently, many studies have demonstrated that microRNAs (miRNAs) are involved in the drug resistance of ovarian cancer cells. In this study, we explored the role of miR-503 in cisplatin-resistant ovarian cancer.

Materials and Methods

To investigate the relationship between miR-503 expression and the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin, the cells were transfected with miR-503 mimics/inhibitors. The relative expression of miR-503 RNA and its targeted gene PI3K mRNA were detected by real-time PCR (RT-PCR). Western blot was used to measure relevant protein levels. Flow cytometry and CCK-8 assay were used to analyze cell proliferation and apoptosis.

Results

MiR-503 expression was significantly downregulated in cisplatin-resistant ovarian cancer cell line SKOV3/DDP compared with parental SKOV3. Over-expression and knock-down of miR-503 partially regulated apoptotic activity and changed the cisplatin resistance of ovarian cancer cells. In exploring the underlying mechanisms of miR-503 in ovarian cancer cells’ resistance to cisplatin, we found that miR-503 can directly target PI3K p85 and participates in the regulation of the PI3K/Akt signaling pathway. In vivo, miR-503 agomirs combined with cisplatin treatment significantly reduced the growth of tumors compared with cisplatin alone.

Conclusions

Our data suggest that miR-503 might be a sensitizer to cisplatin treatment in ovarian cancer by targeting PI3K p85, thus giving a new insight into developing therapeutic strategies to overcome cisplatin resistance in ovarian cancer.

     

Elevated phosphatidylinositol 3-kinase activation and its clinicopathological significance in cervical cancer

OBJECTIVE: The objective was to study the role of PI3K signaling in the development of cervical cancer and the antitumor effect of PI3K inhibitors. STUDY DESIGN: PI3K protein and mRNA expression of cervical cancer and non-neoplastic tissues were analyzed by Western blotting and RT-PCR. PI3K/Akt/mTOR pathway components in HeLa cells were assessed by immunocytochemistry and Western blotting. The inhibitive effect of LY294002 on HeLa cells was studied using MTT assay and flow cytometry. RESULTS: PI3K protein expression was detected in 25 out of 31 tumor specimens. Compared with non-neoplastic tissues, significant overexpression was observed in tumor tissues. For PI3K overexpression with all clinicopathological features, a decreasing trend in adenocarcinoma, advanced stage, and grade was observed. PI3K inhibitor LY294002 efficiently inhibited HeLa cell growth with IC50 of 20.77 microM, and induced apoptosis. The apoptotic rate was 36% at 3h after LY294002 treatment. These pharmacological roles of LY294002 might be played through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. CONCLUSIONS: The PI3K signaling pathway was implicated in the development of cervical cancer. The activation of its signaling molecules might have clinical implications. Novel targeted therapies for the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway components could provide a useful adjuvant therapeutic strategy for cervical cancer.     

抑制磷脂酰肌醇-3-羟基激酶/蛋白激酶B信号传导通路对宫颈癌放疗增敏的作用

目的:探讨抑制磷脂酰肌醇-3-羟基激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号传导通路对宫颈癌的放疗增敏作用。方法:选用LY294002为PI3K阻滞剂。培养PI3K功能活性和AKT磷酸化水平稳定的人宫颈癌HeLa细胞株,皮下注射于BALB/C裸鼠体内,建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型。随机将荷瘤裸鼠分为空白对照组、单纯放疗组、单纯药物组(LY294002)和联合治疗组(放疗+LY294002)。应用Western blotting检测各组AKT磷酸化(phospho-Ser473AKT)水平。通过克隆形成实验检测LY294002在体内的放射增敏作用。长期观察肿瘤体积的变化并绘制肿瘤生长曲线。结果:Western blotting显示,联合治疗组的AKT去磷酸化现象最显著。克隆形成实验显示,LY294002与放射治疗对肿瘤细胞生长的抑制在各剂量水平均表现出协同作用(P0.05)。肿瘤生长曲线表明联合治疗组的肿瘤体积增长最缓慢。结论:PI3K阻滞剂显著增强宫颈癌对放射治疗的敏感性。     

17β-雌二醇对子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路的激活作用

目的　探讨 17β 雌二醇 (E2 )对子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞磷脂酰肌醇 3激酶 /蛋白激酶B(PI 3K/PKB)信号传导通路的激活作用以及PI 3K抑制剂对其的影响。方法　应用免疫印迹杂交技术 ,检测一定浓度 (1× 10 -6mol/L) 17β E2 作用于Ishikawa细胞不同时间 (分别为 0、5、15、30、6 0、12 0min)后和不同浓度 (分别为 0、1× 10 -10 、1× 10 -8、1× 10 -6、1× 10 -4mol/L) 17β E2 作用Ishikawa细胞一定时间 (30min)后PKB的活化情况 [以磷酸化PKB和总PKB比值 (p PKB/PKB)表示 ],以及用同法检测PI 3K抑制剂LY2 94 0 0 2对 17β E2 活化PKB的影响。结果　 1× 10 -6mol/L 17β E2 作用于Ishikawa细胞 15min时 ,PKB的活化水平 (0 5 33± 0 0 2 9)已明显高于对照 (0 36 1± 0 0 2 9,P <0 0 5 ) ,30min时最明显 (0 6 6 6± 0 0 2 1,P <0 0 0 1) ,而且持续至少达 12 0min时 ;随着 17β E2 浓度 (分别为 1× 10 -10 、1×10 -8、1× 10 -6、1× 10 -4mol/L)的增加 ,PKB的活化水平逐渐增高 ,与对照比较 ,差异有显著性 (除 1×10 -10 mol/L外 ,P值分别为 >0 0 5、<0 0 5、<0 0 5、<0 0 0 1)。随着LY2 94 0 0 2作用浓度 (分别为 0 1、10、5 0、10 0 μmol/L)的增加 ,17β E2 作用Ishikawa细胞后P     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

抑制PI3K/Akt信号通路拮抗胰岛素诱导的子宫内膜癌细胞增殖

目的:研究抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路对胰岛素诱导的子宫内膜癌细胞增殖的拮抗作用。方法:将无血清饥饿的子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞分为空白对照组、10-6mol/L胰岛素单独刺激组以及不同剂量PI3K抑制剂-LY294002预处理后再用胰岛素刺激组。Western blot检测各组Akt磷酸化(p-Akt)水平,MTT试验观察细胞增殖情况。结果:胰岛素可引起内膜癌细胞Akt活化,刺激15min后p-Akt/Akt比值显著高于空白对照组(68.68%vs 26.21%,P<0.001)。LY294002以浓度依赖方式抑制胰岛素引起的Akt磷酸化。MTT试验显示,在药物处理24h,48h和72h 3个时间点,不同组别570nm吸光度值(OD570nm)均有显著差异(F=156.329,700.973,812.224,均P<0.001)。胰岛素组OD570nm值均高于同时间点的空白对照组(均P<0.001),胰岛素促内膜癌细胞增殖作用于48h时最为显著。LY294002可抑制胰岛素的增殖促进作用,此抑制作用具有浓度依赖性。不同剂量LY294002抑制作用的时间依赖性不同,48h时小剂量(0.1、1、10μmol/L)的抑制作用最为显著,72h时胰岛素重新呈现一定的促增殖作用;而50μmol/L LY294002可以持久抑制胰岛素的促增殖作用。结论:PI3K抑制剂LY294002可以通过抑制Akt磷酸化阻断胰岛素信号传导,拮抗后者促子宫内膜癌细胞增殖的作用。     

间隙连接蛋白43的磷酸化调节在卵巢上皮性癌化疗耐药中的作用

目的 通过检测卵巢上皮性癌(卵巢癌)间隙连接蛋白43(Cx43)、非磷酸化Cx43及蛋白激酶C(PKC)的表达,探讨Cx43的磷酸化调节在卵巢癌化疗耐药中的作用.方法 采用免疫组化法检测29例化疗敏感(化疗敏感组)和28例化疗耐药(化疗耐药组)卵巢癌患者癌组织中以及PKC抑制剂--星孢菌素处理后的卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP细胞中Cx43、非磷酸化Cx43及PKC蛋白的表达,并采用三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤药敏实验(ATP-TCA)检测SKOV3/DDP细胞对化疗药物的敏感性.结果 (1)免疫组化法检测显示,化疗耐药组Cx43和非磷酸化Cx43蛋白的阳性表达率(分别为54%和14%)明显低于化疗敏感组(分别为83%和59%,P<0.05);化疗耐药组PKC蛋白的阳性表达率明显高于化疗敏感组(分别为64%和31%,P<0.05).卵巢癌组织中,PKC蛋白的阳性表达率与Cx43、非磷酸化Cx43蛋白的阳性表达率呈明显负相关关系(r=-0.626和-0.714,P<0.05).(2)免疫组化法检测显示,星孢菌素处理后SKOV3/DDP细胞中PKC蛋白的表达强度减弱,Cx43及非磷酸化Cx43蛋白的表达强度增强,随着星孢菌素处理时间的延长,Cx43蛋白的表达强度进一步增强.(3)ATP-TCA检测显示,体外培养的SKOV3/DDP细胞对紫杉醇和顺铂均耐药;紫杉醇和顺铂分别联合星孢菌素处理后细胞敏感度增加,其中联合低浓度(1×10-8 mol/L)星孢菌素者为中度敏感.联合高浓度(1×10-7 moL/L)星孢菌素者为高度敏感.结论 PKC通过对Cx43的磷酸化作用导致Cx43蛋白的表达下降,降低卵巢癌对化疗药物的敏感性,这种效应可以被星孢菌素逆转.