Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌

目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16S rDNA和mip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5′端分别标记FAM和HEX,3′端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团菌属结果均为16S rDNA阳性(LP12、LP13除外);嗜肺军团菌均为mip阳性,非嗜肺军团菌属除L.micdadei外均为阴性;而非军团菌菌株16S rDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝/反应;重复性实验中,变异系数为0.2%~0.6%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法,可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属,该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估,以及应急临床标本的快速定量检测。     

阴道毛滴虫与人型支原体共生对AP33基因序列的影响

目的研究河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况,并观察其共生对阴道毛滴虫AP33基因序列的影响。方法应用人型支原体及AP33基因的特异性引物对41株阴道毛滴虫临床分离株进行PCR扩增,扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,对AP33基因扩增产物测序,测序结果与GenBank已知序列比对,绘制进化树。结果有34株阴道毛滴虫扩增出人型支原体的特异性片段,大小为334bp;所有虫株均扩增出AP33基因特异性片段,碱基序列相似性为96．8％～99．3％,有多个位点发生突变。进化树分析提示人型支原体的共生对AP33基因序列有一定影响。结论河南地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生具有普遍性,其共生对阴道毛滴虫的基因序列有一定影响。     

贵州省2011年黑线姬鼠钩端螺旋体分离株16S rRNA基因序列分析及基因种鉴定

摘要 目的 了解贵州省钩端螺旋体病（简称钩体）病原学特征,分析2011年贵州省钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株16S RNA基因序列并对其进行基因种鉴定,为贵州省钩体病的有效预防和控制提供科学依据。方法 应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,从NCBI数据库下载钩体17个基因种代表菌株及及伊尼利螺旋体和短小螺旋体16S rRNA基因序列,采用生物信息软件比较分离株和各基因种代表株间的核苷酸序列,分析其亲缘进化关系,确定分离株基因种。结果 通过PCR扩增和基因测序技术获得4株钩体分离株16S rRNA基因核苷酸序列（1492 bp）,4株钩体分离株的核苷酸同源性为100%,与17个钩体基因种中的问号钩体（L. interrogans）基因种黄疸出血群代表菌株的同源性最高（99.9%）,系统进化树分析显示,钩体分离株与17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体形成致病性、非致病性、未知致病性和其它分支,贵州4株分离株分属于致病性基因种分支,其中与致病性钩体8个基因种中的问号钩体基因种亲缘关系最近。结论 贵州省2011年钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株均属致病性钩体的L. interrogans 基因种,该基因种菌株可能为当地流行菌株,该结果将为贵州省钩体病的预防和控制提供科学依据。     

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性.方法:在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV DNA、37份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增.结果:7种对照菌株均获得530 bp DNA片段.而与人基因组DNA、HBV DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA.37份腹水中有9份获得53bp DNA片段,阳性率24.3%(9/37),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),两者比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究.     

一株致仔猪腹泻大肠杆菌的分离与鉴定

目的对病死仔猪肠道内分离的大肠杆菌进行分离培养,通过常规生化反应及毒力基因和分型基因的分子生物学检测对分离株进行初步鉴定。方法应用多重PCR检测方法进行毒力基因的检测,经细菌16S rDNA全基因扩增测序,Flic基因扩增测序,Blast分析,对分离的大肠杆菌进行初步分型鉴定。结果通过对分离菌株基因组DNA的多重PCR分析,发现该菌株含大肠杆菌耐热肠毒素和不耐热肠毒素致病基因。通过细菌16S rDNA全基因扩增测序,Flic基因扩增测序,Blast分析显示该分离株为H10。其中16S rDNA全基因与H10菌株同源性在99%,Flic基因与H10菌株同源性在98%。结论所分离的猪肠道致病性大肠杆菌为H10,其含耐热肠毒素和不耐热肠毒素致病基因。     

恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达

目的　克隆恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶 (ALD)编码区基因。　方法　利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达。　结果　PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同。重组融合蛋白通过镍 次氮基三乙酸(NiNTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化。　结论　我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达     

嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究

目的了解南昌市宾馆业中央空调冷却塔水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征。方法 6株分离嗜肺军团菌菌株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为Lp1型嗜肺军团菌后,利用PCR技术对军团菌属5SrRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用多位点测序(SBT)分析,获得相应的SBT型别。使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术,对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics数据库软件进行分型分析。结果所有的菌株均带有属特异性5SrRNA基因及mip毒力基因,SBT分型6株菌均为ST1型,PFGE聚类分析结果显示菌株带型之间有差异,6株菌可分为4种带型。结论南昌市公共场所冷却塔水中分离的Lp1型嗜肺军团菌菌株基因呈多样性。     

型特异性基因鉴定法确定蓝氏贾第鞭毛虫C2株基因型的研究北大核心CSCD

目的鉴定中国四川蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)C2株的型特异性基因,为其基因分型提供依据。方法根据GenBank中收录的贾第虫基因序列,选取贾第虫WB株的2个型特异性基因和GS株的5个型特异性基因,设计引物,以C2株基因组DNA为模板,进行PCR反应。从中选取一个没有PCR产物的基因设计外围引物(该引物预期能扩增出此基因的侧翼序列和其相邻基因的部分序列),再次进行PCR反应。将纯化的PCR产物克隆至pMD19-T载体并测序。型特异性基因的缺失通过对其相邻片段的扩增验证。结果从中国四川贾第虫C2株基因组DNA中成功扩增出贾第虫WB株的2个型特异性基因GL50803_3386和GL50803_4447,扩增片段长度分别为1 586bp和1 080bp,并证实其缺失1个贾第虫GS株的型特异性基因GL50581_2613。结论中国四川贾第虫C2株可能属于贾第虫WB株。     

江西地区啮齿动物中温州病毒的检及病毒基因特征分析

目的 了解温州病毒在江西地区啮齿动物中感染的情况及病毒基因特征。方法 收集2021年江西省高安市、安义县两地啮齿动物鼠肺组织样本,提取样本核酸,采用温州病毒特异性引物进行巢式PCR扩增,PCR产物进行序列测定。采用Ion GeneStudio S5 二代测序平台(NGS)对1株核酸阳性样本进行病毒基因组测序,采用CLC软件对基因序列进行分析。结果 共收集高安市、安义县啮齿动物肺组织标本164份,通过巢式PCR检出温州病毒3份,均来自高安地区的黄毛鼠。3株病毒部分L基因序列同源性93.66%~98.50%,氨基酸序列同源性95.21%~100%。选取1株病毒(JXGAW45/2021)进行二代测序,获得全基因组序列,其中S、L基因分别含3 429、7 145个核苷酸。基因组比对分析发现JXGAW45/2021与其他温州病毒核苷酸序列同源性为82.58%~85.75%,氨基酸同源性为88.76%~96.83%,在S、L基因系统进化树中均独立分支,为温州病毒新的变异株。结论 首次在江西地区啮齿动物中发现温州病毒。     

Cardiobacterium valvarum临床分离株的生物学特性研究及16S rRNA鉴定

目的 采用不同的方-法描述Cardiobacterium valvarum(C. valvarum)临床分离株的生物学特性,利用16S rRNA基因测序技术进行分子鉴定。 方-法 转种阳性血培养标本到血琼脂平板上进行细菌培育,革兰染色涂片镜检,用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪对临床分离株进行细菌鉴定,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对分离株的蛋白质进行高通量测定,E-test法对分离株作药敏试验。提取分离株的DNA,采用16S rRNA基因测序技术对PCR的产物进行测序,在NCBI的BLAST网站上与GenBank数据库上的序列做相似性比较,用MEGA7.0.26软件构建该分离株的系统进化树。结果 经细菌培养发现小而圆、光滑、不透明,灰色的菌落;经革兰染色后镜下见到小、两端圆形、革兰阴性的多形性杆菌;VITEK 2 Compact上机、MALDI-TOF-MS技术均未得到该分离株的鉴定结-果;16S rRNA基因测序技术测得该菌株基因全序列约为1 450 bp,与C. valvarum F0432的16S rRNA同源性为99.59%,鉴定为C. valvarum。结论该菌的形态、生化反应均无代表性,采用16S rRNA基因测序技术可以对C. valvarum进行鉴定,对该疾病的诊断具有重要意义。     

棘阿米巴土壤分离株CB/S1的18S rDNA基因型鉴定

目的鉴定从北京市区土壤中分离的棘阿米巴分离株Acanthamoeba sp．CB／S1的18S rDNA基因型。方法从土壤分离的CB／S1株中提取基因组18SrDNA，应用棘阿米巴属特异性引物PCR扩增18S rDNA序列。将扩增产物测序后用分子生物学软件Clustal X进行序列分析，与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果与结论从北京市区土壤中分离的的棘阿米巴分离株CB／S1的18S rDNA全基因序列分别为2291bp，其基因型属于T5型。     

我国首株牛源贾第虫的分子鉴定

目的通过16S及内转录间区(ITS)rDNA基因序列的扩增、克隆以及序列分析,从分子水平对首次在我国分离的一株牛源贾第虫进行种类及基因型鉴定。方法根据GenBank中登录的贾第虫rRNA基因序列,设计引物,采用热启动-降落PCR方法从牛源贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,经TA克隆至pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,然后进行序列分析。结果成功地扩增出该株牛源贾第虫的16S rRNA全基因及rDNA ITS序列,大小为1 715 bp,包括1 447 bp的16S rDNA全长序列和243 bp的ITS间区序列,以及25 bp的26S rDNA基因5'末端。序列分析表明此牛源贾第虫为E型蓝氏贾第虫。结论本研究从分子水平鉴定我国首株牛源贾第虫为蓝氏贾第虫(E型),并首次报道了该虫株的rDNA 16S及ITS序列,为牛源贾第虫的进一步研究奠定了基础。     

蜱中人粒细胞埃立克体DNA的PCR检测及序列分析

目的了解吉林地区蜱种感染人粒细胞埃立克体的情况。方法采用16S rRNA基因特异引物进行半套式PCR,检测吉林省部分林区蜱中人粒细胞埃立克体DNA,并对扩增产物进行克隆和测序,与已知序列进行同源性比较。结果从采集于吉林地区的全沟硬蜱中检出人粒细胞埃立克体的特异性DNA片段,阳性率为1.98%。扩增产物经克隆、测序发现吉林地区人粒细胞埃立克体扩增片段与美国人粒细胞埃立克体分离株(GenBank注册号为U02521)16SrRNA基因序列相对应片段相差2个核苷酸,同源性为99.7%。结论吉林地区的全沟硬蜱携带人粒细胞埃立克体,提示吉林地区可能存在人粒细胞埃立克体病的自然疫源地。     

合肥地区奶牛源隐孢子虫的分离与鉴定

目的分离合肥地区奶牛源隐孢子虫,并鉴定其种类。方法采集安徽省合肥市某奶牛场285头成年母牛粪样,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测牛粪中隐孢子虫卵囊,并分离纯化隐孢子虫阳性粪样中的卵囊,抽提其基因组DNA作为模板,根据隐孢子虫18S rRNA和HSP70基因设计引物,用PCR和巢式PCR方法扩增目的片段,对巢式PCR产物进行克隆、测序,并运用DNAStar软件对序列进行同源性比对,构建系统进化树。结果两种方法检测均为阳性的粪样有5份,感染率为1.8%(5/285)。隐孢子虫卵囊呈椭圆或卵圆形,饱和蔗糖溶液漂浮法分离的隐孢子虫卵囊大小为7.37μm×6.13μm,形状指数(长/宽)为1.20;改良抗酸染色法检获的隐孢子虫卵囊大小为7.58μm×6.20μm,形状指数为1.22。巢式PCR扩增出的18S rRNA和HSP70基因片段分别为250 bp和325 bp。合肥奶牛源隐孢子虫5株分离株18S rRNA基因与安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)DQ989573序列一致性最高,两者在系统进化树上为同一分支。这5株分离株的HSP70基因序列与安氏隐孢子虫AY954892和D...     

重庆地区肺炎衣原体感染株的部分基因分析

目的 用两对引物对临床标本中肺炎衣原体进行检测，对阳性PCR产物部分序列进行测定和同源性分析，探讨肺炎衣原体的基因分型。方法 用根据肺炎衣原体16s rRNA及种特异性53kDa蛋白抗原基因序列设计的两对引物Cpnl～Cpn2,53A～53B对1994年5月～1999年3月间采集的呼吸道疾患病人的鼻咽拭子标本182份进行PCR检测，从阳性标本中随意挑取136和144号标本，纯化PCR产物，进行核苷酸测序，并将测序结果与已报道的肺炎衣原体分离株进行同源性比较分析。结果 标准AR-39株及21例标本均扩增得到约460nts的16s rRNA基因片段，25例标本扩增得约830nts的53kDa蛋白基因核酸片段。对136、144号标本的PCR产物测序结果显示，244nts的16s rRNA基因序列完全相同，且与标准肺炎衣原体AR-39、TW183、IOL207及CWL029的对应序列100%同源，而与马肺炎衣原体分离株N16相比较有3处突变，与非洲热带蟾蜍分离株CPXT1比较有3处突变，与小鼠肺炎衣原体分离株J138相比有一处不同，表明人的肺炎衣原体株16r RNA基因较为保守，与动物分离株有差异；标本145nts的53kDa蛋白基因也100%同源，该序列与从人体分离的AR-39株以及从小鼠分离的J138株序列完全一致，表明肺炎衣原体53KDa蛋白抗原是高度保守的种特异性抗原。结论 衣原体的基因型分析有助于研究其流行规律，更好地进行疾病监控，但肺炎衣原体的进一步分型研究尚有赖于发掘其它可用作分型的基因及对更多的分离株进行分析。     

产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究

目的　建立产单核细胞李斯特菌的分子检测方法及其亚分型体系。方法　对LM菌株进行hly基因的PCR检测 ,并扩增其中 10株PCR检测阳性菌株的actA基因 3’末端的 82 7bp的DNA片段 ,对扩增的片段进行测序。利用遗传进化树分析软件分析。结果　 2 4株LM的hly基因扩增均出现 85 0bp左右特异性片段 ,而非LM株未出现该特异性片段。所建立的分子亚分型方法将 10株LM归为两个遗传谱系。结论　新建立的PCR法检测LM具有较高的灵敏性与特异性 ,LM分子亚分型体系的建立为进一步研究不同LM分离株的群体遗传学、流行病学及生态学奠定了技术基础。     

4种病原菌特异基因片段阳性蜱的16S rRNA基因克隆文库分析

目的 建立16S rRNA基因克隆文库分析蜱媒菌群的方法,观察该方法对蜱寄生病原菌的检测效率以及对细菌群落多样性分析和对病原菌的筛检能力.方法 用伯氏疏螺旋体、汉赛巴通体、嗜吞噬细胞无形体和查菲埃立克体4种病原菌特异基因设计引物,扩增蜱标本提取的核酸,以上述4种病原菌特异基因片段扩增均阳性的蜱核酸提取物做模板,用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序,建立16S rRNA基因克隆文库,将测序结果与数据库进行比对,计算克隆文库Coverage值和Shannon-Wiener多样性指数.结果 测出103个有效序列,检出16种已知种属的细菌,其中8个是优势类型(克隆子数>5个);检测到伯氏疏螺旋体、汉赛巴通体和立克次体3种病原菌,但这3种病原菌均不是优势类型(克隆子数均<5个).Coverage值为96.11%,Shannon-Wiener多样性指数为2.40.克隆序列分析结果表明,蜱寄生细菌主要为α、γ变形菌纲,占56.25%(9/16).结论 16S rRNA基因序列分析可以对蜱标本进行菌群相对定量研究,可以同时检出多种病原菌,是一种较好的细菌菌群多样性分析和病原菌筛检方法.     

聚合酶链反应结合地高辛标记寡核苷酸杂交检测肠道致病菌的应用

16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,既保守又相对,呈现出保守区和可变区交错排列的状态.根据这些特点,我们在16S rDNA保守区设计聚合酶链反应（PCR）引物,用一对通用引物在适宜的PCR反应条件下就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来,同时利用可变区设计地高辛标记的种特异性寡核苷酸探针与扩增产物进行斑点杂交而区分不同细菌.现报告如下.     

利用基因芯片快速检测多种临床常见致病菌及其耐药性基因

目的快速、准确、灵敏地检测临床常见的致病菌及其耐药基因。方法采用基因芯片技术，利用细菌23S rRNA基因序列信息和某些耐药基因作为检测靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针和耐药基因探针的基因芯片，聚合酶链反应（PCR）扩增并荧光标记目的DNA片段，通过杂交反应检测致病菌及其耐药基因。结果在理想状态下（检测试剂盒抽提的细菌基因组DNA）检测的结果与国内外文献报道的灵敏度相当（10^3～10^6细菌／ml），并在部分临床分离株、耐药标准菌株中进行验证，显示该方法有良好的特异性及可重复性。细菌种类能鉴别到种水平的有16种，能鉴别到属水平的有7类。覆盖了临床常见的多种病原菌，并且还可同期检测超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因耐药。结论DNA芯片检测具有快速、高特异性和高灵敏度的特点，是常规鉴定方法的一种有益补充。     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。