荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫感染的敏感性研究

目的建立快速、敏感、特异的检测日本血吸虫感染的SYBR Green荧光定量PCR法,准确评估其敏感性。方法将计数的日本血吸虫虫卵掺人健康水牛粪样中,制备人工阳性粪样。采用改良QIAamp DNA Stool Kit粪样DNA提取方法,提取人工阳性粪样DNA,进行SYBR Green荧光定量PCR,建立Ct值与粪样中克粪虫卵数（EPG）的关系;提取单独（不与牛阴性粪样混合）日本血吸虫虫卵DNA与虫卵生理盐水冲洗液DNA,行定量PCR检测,以对本方法进行严格质量控制。结果每200mg粪样仅含1个虫卵时,荧光定量PCR仍呈阳性,人工阳性粪样EPG的对数与PCR的Ct值存在线性关系。结论SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫虫卵DNA敏感性高,EPG对数与PCR的Ct值存在线性关系。     

贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立及对云南鼠标本检测

目的 建立贝氏柯克斯体荧光定量PCR方法并应用于云南省鼠标本的检测.方法 根据贝氏柯克斯体ISlllla基因设计引物和探针,以克隆的ISlllla基因片断(485 bp)作标准DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与普通巢式PCR方法进行比较.采用2种方法对云南玉溪自然界采集的鼠各类标本进行检测分析,计算2种方法的检出率.结果 实时荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(cycle threshold,Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=-0.999),重复性测试Ct变异系数(coefficient of variation,CV)为0.25%～3.98%,灵敏度为巢式PCR的10倍.以其他立克次体和常见病原菌共26种DNA为模板进行特异性检测,结果均为阴性.实时荧光定量PCR检测鼠血、肝脏、脾脏中的贝氏柯克斯体,阳性率分别为32.31%、61.29%、85.19%;巢式PCR法检测相应标本阳性率分别为27.69%、11.29%、74.07%;间接免疫荧光试验检测鼠血清中贝氏柯克斯体IgG抗体阳性率为26.15%.结论 本实验建立的实时荧光定量PCR比巢式PCR敏感,且具有良好的特异性,可用于人群和动物贝氏柯克斯体感染监测及临床标本的检测.     

实时荧光定量PCR检测五日热巴通体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）方法。方法 根据五日热巴通体特异的16-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针，以克隆的16-23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板，建立了检测五日热巴通体实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．996）；与普通PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度约为它的200倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌，检出结果为阴性。实时荧光定量PCR检测五日热巴通体实验感染小鼠血、脾脏、肝脏和肺组织DNA样本，脾脏和肝脏样本中检出较高水平五日热巴通体DNA，血和肺部检出的目的DNA的水平较低。结论 本研究建立的检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR法具有很高的检测灵敏度和特异性，可用于临床患者血样本的检测，作五日热的早期诊断。     

检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA套式-实时荧光定量聚合酶链反应的建立

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的套式一实时荧光定量PCR法.方法 根据HBV cccDNA与松环DNA(rcDNA)结构上的差异,设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺口下游的特异TaqMan荧光探针.根据Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnasc(PSAD)对rcDNA与cccDNA作用的不同,对模板DNA进行酶切纯化,降解reDNA,再进行套式PCR扩增,先用外引物和模板进行第一轮常规PCR,再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照标准品,得出待检标本定量值.结果 检测阳性参照标准品.得出该方法灵敏度可达2 lg拷贝/mL.用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV DNA阳性标本,25份血清HBVcccDNA阳性,28份外周血单个核细胞HBV cccDNA阳性.27份健康对照者血清HBV DNA阴性标本,6份HBV cccDNA阳性.对5份HBV cccDNA阳性标本扩增产物进行克隆测序,无碱基缺失、突变.与HBV不同基因型序列(A～G)比较,同源性为90.6%～99.1%,其中,与B、C基因型同源性为95.3%～99.1%,验证了方法的特异度.结论 套式-实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV CCCDNA,且具有敏感、特异性.     

基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价

目的 建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法 根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果 建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论 本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。     

不同实时荧光定量PCR仪对外周血中EB病毒DNA检测结果的影响

目的:应用同一种商品化EB病毒核酸定量检测试剂盒在2款实时荧光定量PCR仪同时检测外周血标本中EB病毒载量,探讨不同类型的实时荧光PCR仪对EBV DNA定性和定量检测结果的影响.方法:提取179例外周血标本(包括102例全血和77例血浆)的DNA后,应用EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)分别在2款实时荧...     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

荧光定量聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的建立检测肺炎支原体的荧光定量PCR法,并与市售试剂盒和传统巢式PCR法的检测性能进行比较。方法设计针对肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征毒素基因的特异性引物,构建含相应目的片段的质粒作为标准品,采用SYBR Green染料法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线。通过检测其他细菌和170例儿童临床咽拭子样本,比较新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法在临床应用中的差异。结果新建荧光定量PCR法和巢式PCR法能够检出的肺炎支原体标准株DNA最低模板量为10拷贝,市售试剂盒检出最低模板量为102拷贝。在特异性实验中3种方法均可区分肺炎支原体和其他菌种。在检测的170例儿童临床咽试子样本中,新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法的阳性率分别为60.00%、50.00%和53.53%。新建荧光定量PCR法与市售试剂盒的结果具有高度相关性(r=0.953),2种方法的总符合率为86%,Kappa值为0.729。新建荧光定量PCR法与传统巢式PCR法的结果总符合率为90%,Kappa值为0.797。结论新建荧光定量PCR法与市售试剂盒相比灵敏性更高,特异性相同,成本低;与传统巢式PCR法相比操作简单,耗时短且污染少,具有良好的科研和临床应用前景。     

磁珠提取法和离心柱提取法在实时荧光定量聚合酶链反应中幽门螺杆菌核酸提取效果的对比研究

目的比较磁珠提取法和离心柱提取法在实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)中幽门螺杆菌(HP)核酸提取效果、重复性及临床标本检测能力。方法将100~10-6系列梯度稀释的HP标准菌株作为模板,分别采用磁珠提取法和离心柱提取法平行提取HP核酸,比较两种提取方法的核酸提取效果、变异系数(CV);将35份胃液标本作为模板,分别采用磁珠提取法和离心柱提取法平行提取HP核酸,比较两种提取方法对临床标本的检测能力。结果两种核酸提取方法提取100、10-5浓度HP标准菌株核酸的CT值比较,差异无统计学意义(P0.05);离心柱提取法提取10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-6)浓度HP标准菌株核酸的CT值低于磁珠提取法(P0.05)。两种提取方法提取HP标准菌株核酸的CV比较,差异无统计学意义(P0.05)。两种提取方法提取胃液HP核酸的CT值比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论磁珠提取法在实时荧光定量PCR中的HP核酸提取效果优于离心柱提取法,而其重复性及临床样本检测能力与离心柱提取法相当。     

直接PCR法在口腔牙龈卟啉单胞菌检测中的应用

目的为了便于食管癌大规模流行病学筛查工作的开展,探讨一种能快速敏感地检测口腔牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)DNA的免核酸抽提直接PCR方法。方法收集我院门诊100例体检人员的200份口腔拭子(每人双份),以TE buffer(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 8.0)、商品化裂解液以及核酸抽提试剂盒等作为基因组提取试剂,使用P.gingivalis特异引物探针进行直接定量PCR检测。结果与裂解液-直接qPCR法相比,TE-直接qPCR法的灵敏度为94.12%,特异性为100%;与试剂盒-qPCR法相比,TE-直接qPCR法的灵敏度与特异性均为100%;TE-直接qPCR法与裂解液-直接qPCR法以及与试剂盒-qPCR法检测P.gingivalis均具有高度一致性(分别为Kappa=0.954,Kappa=1);TE-直接qPCR法与试剂盒-qPCR法检测阳性P.gingivalis的Ct均值无显著差异(P=0.907)。结论TE-直接qPCR法检测口腔P.gingivalis灵敏度高、特异性强,是快速高效检测口腔P.gingivalis的理想方法,可用于食管癌大规模分子流行病学研究。     

实时荧光定量PCR检测布鲁杆菌方法的应用

目的 探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)用于布鲁杆菌检测的可行性.方法 根据布鲁杆菌BCSP31基因设计合成1对引物和TaqMan探针,以克隆有布鲁杆菌基因片段的PMD18-T质粒作为标准品DNA模板,进行FQ-PCR检测,绘制标准曲线;对所应用的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析;并对临床血液标本进行FQ-PCR,与临床诊断进行比较.结果 用标准品DNA建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999);FQ-PCR检测的灵敏度拷贝数为5个/μl,普通PCR为5×102个/μl,FQ-PCR是普通PCR的100倍;用FQ-PCR检测6株布鲁杆菌菌株及5株非布鲁杆菌菌株,布鲁杆菌均检出较强荧光信号,非布鲁杆菌未检出;5×103个拷贝/μl标准品DNA检测后,Ct值批内变异系数(CV)为0.71%,批间CV为7.23%;用FQ-PCR检测临床确诊阳性血标本24份,检出阳性19份,符合率为79%(19/24),阴性对照血标本31份,全部阴性,阴性符合率为100%(31/31),临床症状可疑标本30份,检出阳性2份.结论 用FQ-PCR方法检测布鲁杆菌具有高度敏感性、特异性及良好的重复性,与临床阳性及阴性标本的符合率较高,可用于快速检测各种样本中的微量布鲁杆菌以及作为布鲁杆菌感染的实验室检测方法.     

用PCR技术直接检测致病真菌的实验研究

目的　建立和评价从血标本中直接PCR检测病原真菌的方法。方法　用红、白细胞裂解液 ,基因释放剂等直接处理血标本 ,提取微量的靶DNA ,然后用真菌通用引物及种特异性引物进行PCR扩增。结果　在几种重要致病真菌制备的人血标本中检测出靶DNA ,其敏感性达 10个孢子 /ml以下 ,且从标本处理到报告结果仅需 6h。结论　用PCR方法可简便快速特异敏感地从血标本中直接检测病原真菌 ,提示可为临床快速诊断深部真菌病打下基础。     

弓形虫SYBR-Green1荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立SYBR-Green1荧光定量PCR检测弓形虫的方法,并进行实验室方法学评价。方法常规PCR扩增弓形虫RH株高度保守的B1基因部分序列,经TA克隆后转化入大肠埃希菌JM109中。提取重组质粒,PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green1荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验,对桂弓、B36虫株及恶性疟原虫、血吸虫基因组DNA、30份孕产妇标本1、221份无偿献血者标本进行检测。结果用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数0.997,平均试验间变异系数0.81%,检测桂弓、B36虫株均为阳性,而检测血吸虫、恶性疟原虫基因组DNA均为阴性;孕产妇检测阳性率16.7%,平均拷贝数为1.19×105cop-ies/μl;无偿献血者阳性率为0.74%,平均拷贝数为1.17×105copies/μl。结论成功建立了检测弓形虫B1基因的SYBR-Green1荧光定量PCR方法,较常规PCR技术更快捷、敏感、准确,适合临床实验室及无偿献血者的筛查使用。     

婴幼儿腹泻粪便标本菌群的16S rDNA PCR-DGGE分析

目的探讨DGGE技术对常见肠道病原菌的区分能力及腹泻病人粪便标本中的菌群组成和变化情况。方法采用细菌的16S rDNAV3区通用引物,以常见肠道病原菌的染色体和腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增后进行DGGE分析及优势条带的序列分析。结果6份粪便标本的DGGE图谱均表现为高度多态性,不同标本之间优势带型存在很大的差异。序列分析显示每份粪便标本中的DGGE优势带型由不同的细菌组成,而且其中非可培养细菌占较大比例,恢复期病人的粪便标本中双歧杆菌和/或乳杆菌成为优势菌型。结论PCR-DGGE能够有效区分不同种属的常见肠道病原菌,技术可为常规的病原菌分离培养方法提供补充,用于腹泻粪便标本的菌群分析,为疾病诊断提供线索。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立快速、特异、灵敏的碱性磷酸酶直接(AlkPhos Direc)标记核酸探针检测血清中乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)方法。方法 应用 AlkPhos DirecTM将碱性磷酸酶直接标记在HBV DNA全基因序列上制备探针,与目标核酸杂交后加入CDP-Star化学发光试剂,用胶片放射自显影检测HBV DNA。同时检测探针的灵敏度和特异性。比较AlkPhos Direc标记HBV DNA探针与地高辛标记的HBV DNA探针检测临床血清标本80份结果,并对70份临床血清标本的荧光定量PCR方法检测的结果与AlkPhos Direc标记HBV DNA探针斑点杂交检测的结果作相关性分析。结果 探针灵敏度至少为10pg,与地高辛探针比较,用AlkPhos Direct标记探针检测方法的灵敏度为100％,特异性为100％,符台率为100％,用HBV DNA荧光定量PCR方法和AlkPhos Direct标记探针核酸斑点定量方法检测的结果进行相关性比较,r=0.98,P<0.01。结论 AlkPhos Direc标记 HBVDNA探针检测血清中HBV DNA方法灵敏、特异,与地高辛标记的HBV DNA探针检测结果完全符合,与HBVDNA荧光定量PCR方法硷侧的结果有良好的相关性。     

隐匿性乙型肝炎病毒感染情况调查

目的调查隐匿性HBV感染(OBI)的情况。方法连续收集2016年8月至2017年3月HBsAg(-)且其他HBV标志物阳性患者血清样本1570份,同时排除单独抗-HBs阳性患者。采用全自动磁珠法核酸提取及实时荧光定量PCR系统进行HBV DNA定量检测,同时采用罗氏CAP/Prep HBV检测系统复核。结果 1570份标本中共有71份HBV DNA阳性标本。1570份标本中,肝炎506份,肝硬化399份,肝占位41份,肝癌189份,其他诊断435份。HBV DNA阳性标本中,肝炎31份,肝硬化7份,肝占位3份,肝癌16份,其他14份。71份OBI标本中有7份为健康查体者标本。结论 OBI在人群中有一定的发生率,肝占位和肝癌患者OBI发生率较高,健康体检人群中仍可筛查出OBI者。     

DNA探针诊断肠道感染

近十年来,分子生物学技术已广泛使用于检查病原性微生物。如通过聚合酶链锁反应(PCR)和使用种属特异的寡核苷酸的DNA体外扩增的DNA诊断技术,可识别种属密切相关的病原体,检测出少量的病原菌。这些新技术具快速、简单和便于处理大量标本。可取代显微镜或生物化学的方法检测多种人类肠道致病菌。方法学一股变性DNA(要检测的未知病原的靶DNA)以精确的方式与DNA的互补链杂交即构成DNA诊断的基础。 DNA探针鉴定粪便中肠道病原菌的基本步骤包括,将粪便悬液在缓冲剂中溶解后,置病原菌DNA于硝基纤维素膜或尼龙膜上分离,     

SYBR Green荧光PCR检测美洲钩虫方法的建立

目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS 2序列设计特异引物,PCR扩增ITS 2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS 2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green I荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。