华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

华支睾吸虫PPMP型抗原基因的克隆、表达与免疫原性鉴定

目的筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找和鉴别新颖的抗原基因,并分析其重组蛋白的免疫原性方法以华支睾吸虫病患者混合血清免疫筛选华支睾吸虫成虫λZAP cDNA表达文库,将阳性噬菌体克隆、测序,对获得的核苷酸序列进行生物信息学分析。将目的基因成熟肽的编码区克隆至原核表达质粒pET28b(+),转化至大肠埃希菌BLR(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。以纯化的重组蛋白pET28b-Cs2免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,ELISA检测抗体水平。结果共获得44个阳性克隆,其中3个克隆的氨基酸序列中均含有PPMP重复序列,将其命名为华支睾吸虫PPMP型抗原,将其中含有KPPMPGDRDA、QPPMPGGRDA串联重复多肽序列的抗原分别称为PPMPⅠ型和PPMPⅡ型抗原。经核苷酸序列同源性比较,PPMP型抗原是一个新的华支睾吸虫特异性抗原家族。PPMPⅠ型的Cs2基因和PPMPⅡ型的Cs3基因的成熟肽编码区在大肠埃希菌BLR(DE3)或BLR(DE3)pLysS中表达,并获得可溶性重组蛋白,2个重组蛋白的相对分子质量分别为M_r 22 000和M_r 39 000。重组蛋白可被华支睾吸虫病患者血清所识别。ELISA结果显示,免疫小鼠可产生高滴度(1:64000)特异性IgG抗体。结论发现华支睾吸虫PPMP型抗原基因家族,其重组蛋白具有较强的免疫原性。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

华支睾吸虫19kDa分泌型蛋白(CsSP19)基因的克隆、表达与免疫学功能研究

目的对一个新发现的华支睾吸虫分泌型蛋白的未知基因,进行克隆表达和重组产物的免疫学鉴定,确定其免疫学功能。方法利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中发现一个编码分泌型蛋白的新基因（克隆号Cs004f03）,将去除信号肽序列的编码序列克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,IPTG诱导表达,产物经亲和层析纯化,并制备大鼠免疫血清,Western-blot方法分析其抗原性和分泌性。结果CsSP19开放阅读框（ORF）有564bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21.2kDa,成熟肽的理论分子量为19kDa。该基因的成熟肽编码区在大肠杆菌中可获得高表达,重组蛋白能被华支睾吸虫病人血清所识别,同时,重组蛋白免疫血清也能识别华支睾吸虫分泌排泄抗原中分子量约19kDa的蛋白条带。结论CsSP19蛋白是华支睾吸虫分泌排泄抗原中一个有潜在诊断价值的分泌蛋白。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆表达和血清学诊断效果

目的克隆、表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（CSCP）,并评价其免疫学诊断效果。方法根据已知的CSCP（Gen Bank序列号：AF093242）基因序列设计引物,从华支睾吸虫成虫总cDNA中扩增该目的片段,克隆入真核表达载体pPIC9K,转化至巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,甲醇诱导表达、纯化;采用Westernblot技术鉴定该重组蛋白;用纯化的重组CSCP（rCSCP）免疫小鼠,ELISA法检测抗体效价;应用DotELISA法和Western blot法评估该重组蛋白的诊断效果。结果从华支睾吸虫成虫cDNA中扩增获得长度为927bp的CSCP基因,并成功进行了真核表达、纯化,纯化的rCSCP免疫小鼠后的血清能被华支睾吸虫成虫可溶性抗原识别,其血清抗体效价达1∶64000;采用该重组蛋白建立的DotELISA法检测华支睾吸虫病人的敏感性为91.7%（55/60）,检测正常人的特异性为97.6%（82/84）;Western blot分析显示,rCSCP与日本血吸虫病人血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病人交叉反应率为20.0%（2/10）。结论 rCSCP具有较好的诊断效果,是华支睾吸虫重组蛋白中一个有潜在诊断价值的抗原。     

华支睾吸虫钙结合蛋白Cs16的重组表达及血清诊断应用的初步评价

目的以原核和真核表达系统克隆、表达华支睾吸虫含有EF手型结构域的钙结合蛋白(Cs16),纯化并初步评价其在华支睾吸虫病免疫诊断中的作用。方法以华支睾吸虫成虫c DNA为模板,PCR扩增含有EF手型结构域的Cs16基因,分别构建原核重组质粒p GEX-4T-1-Cs16和真核重组质粒p PIC9K-Cs16,将酶切和测序鉴定正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌BL21和毕赤酵母GS115后,表达并纯化目的蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)验证其纯度及免疫原性。以华支睾吸虫重组蛋白Cs16为包被抗原,采用ELISA检测24例华支睾吸虫病患者血清中相应抗体的反应性及其与日本血吸虫病患者血清的交叉反应性。结果PCR扩增获得Cs16基因片段,大小为515 bp。构建的重组质粒p GEX-4T-1-Cs16和p PIC9K-Cs16经酶切和测序鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,2个重组质粒在大肠埃希菌BL21和毕赤酵母GS115中均为可溶性表达,重组蛋白Cs16相对分子质量约为16 000。Western blotting结果显示,2个重组蛋白能分别被抗GST抗体和抗His抗体特异性识别。ELISA检测结果显示,原核表达和真核表达重组蛋白Cs16的敏感性分别为70.8%(17/24)和54.2%(13/24),特异性分别为95.2%(20/21)和100%(21/21),差异均有统计学意义(P0.05)。与日本血吸虫病患者血清的交叉反应为1/10。结论获得了原核和真核Cs16重组抗原,其在华支睾吸虫病的诊断上具有潜在的应用价值。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

华支睾吸虫Rho GTPase样基因的识别、克隆表达与免疫鉴定

目的 对新发现的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）的Rho GTPase样基因进行克隆、表达和免疫学鉴定。方法 将用生物信息学方法识别的华支睾吸虫cDNA质粒文库中的Rho GTPase样基因的完整编码序列（CDS）克隆到原核表达质粒pET-30a（＋）中，在大肠埃希菌BL21中用IPTG诱导表达。表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹（Western blotting）进行分析，并用镍离子金属螯合亲和层析柱进行纯化。结果 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因的完整阅读框含576个碱基，编码192个氨基酸，理论分子量为21．7kDa。PCR、双酶切及DNA测序的结果均表明重组质粒pET-30a（＋）-Rho GTPase构建成功。SDS-PAGE结果表明Rho GTPase基因在大肠埃希菌BL21中获得了高效表达，重组蛋白可被感染华支睾吸虫的猫血清识别，表明其具有免疫反应性。亲和层析获得了高纯度的蛋白。结论 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因可在原核系统中获得有免疫学活性的高效表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

细粒棘球蚴(中国大陆株)抗原zw-5基因的表达、纯化及免疫学特性初步分析

目的对细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)抗原zw-5重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫学特性。方法从重组质粒Eg.zw-5/pGEM-T中获取抗原zw-5基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白;用Eg.zw-5免疫ICR小鼠,通过Western-blot、ELISA对Eg.zw-5的免疫学特性进行初步研究。结果构建原核重组表达基因工程菌株Eg.zw-5/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出分子量为28kD的重组蛋白。West-ern-blot显示,Eg.zw-5免疫的小鼠血清能识别重组蛋白和天然抗原原头蚴中约28KD处的条带。ELISA检测显示,用Eg.zw-5免疫小鼠,可诱导产生特异性抗体IgG。结论成功表达细粒棘球蚴重组抗原Eg.zw-5,该重组蛋白有较好的免疫原性及抗原性。     

肺炎克雷伯菌FimA的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌毛FimA蛋白并制备多克隆抗体。方法在Clustal Omega网站上比对不同细菌FimA蛋白的同源性。设计特异引物,PCR扩增肺炎克雷伯菌FimA基因,双酶切后将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-FimA。将pET28a-FimA转化表达菌BL21 star(DE3)后培养,使用IPTG诱导FimA蛋白表达。使用IEDG在线网站分析FimA蛋白的B细胞表位,然后用层析纯化的重组FimA蛋白免疫小鼠,获得免疫血清,ELISA检测IgG、IgG1、IgG2a和IgA.结果肺炎克雷伯菌的FimA与其他FimA蛋白同源性较低,为23.6%?30.6%。构建的重组质粒PET28a-FimA在大肠埃希菌中能表达21.6×10^3的重组FimA蛋白,经亲和层析后得到单一电泳条带的高纯度目的蛋白。用FimA蛋白免疫小鼠,获得高滴度的IgG和IgA,且IgG2a的A450值高于IgG1.结论成功构建了表达质粒pET28a-FimA,获得高纯度的重组蛋白FimA。FimA具有免疫原性,用该蛋白免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。     

华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的克隆表达和蛋白纯化

目的原核表达华支睾吸虫鳞状上皮癌相关肿瘤基因(SCCRO)全长编码区序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做好准备。方法用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA文库中识别出与人鳞状上皮癌相关基因的同源序列及其全长编码区,将其编码区序列克隆到原核表达载体PET-30a(+),测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,重组产物用His-镍蛋白纯化柱纯化。结果华支睾吸虫鳞状上皮癌相关基因长度为1 218bp,其全长编码序列长度为780bp,编码259个氨基酸,1-22位为分泌信号肽,在羧基端有一个高度保守的区域。该基因在大肠杆菌中得到了高效的可溶性表达,重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度可达98%。结论鳞状上皮癌相关基因的PET-30a(+)原核重组质粒在大肠杆菌BL-21/DE3中可以稳定高效地表达可溶性蛋白。     

巨片形吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的免疫筛选巨片形吸虫成虫c DNA表达文库,并克隆和重组表达巨片形吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx),初步评价其免疫诊断价值。方法用巨片形吸虫病患者的混合血清免疫学筛选巨片形吸虫成虫λZAP c DNA表达文库,取阳性噬菌体进行克隆、测序及序列比对分析。将TPx基因全长片段和N段截短片段分别克隆至原核表达质粒p ET28a(+)中,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化2种重组蛋白r Fg TPx和r Fg TPx_nt(N端截短型)。以间接ELISA法,检测27例巨片形吸虫病患者治疗前后的血清,15例日本血吸虫病和15例华支睾吸虫病的患者血清,32位健康人血清,评价重组蛋白的免疫诊断价值。结果克隆的巨片形吸虫TPx基因,经原核表达、纯化并复性,获得其可溶性重组蛋白r Fg TPx和r Fg TPx_nt,相对分子质量(Mr)分别为30 000和26 000。以重组蛋白r Fg TPx_nt为检测抗原的ELISA检测的敏感性为66.7%(18/27),特异性为96.8%(60/62),总符合率为87.6%(78/89),与日本血吸虫病和华支睾吸虫病患者血清的交叉反应率分别为0和1/15。巨片形吸虫病患者治疗前后血清的A450值分别为0.233±0.088和0.129±0.072,差异有统计学意义(t=4.27,P0.01)。结论筛选并克隆了巨片形吸虫TPx抗原基因,实现原核表达,并证明该重组蛋白作为人体巨片形吸虫病的免疫诊断抗原具有较好的诊断意义,亦有可能具有早期诊断和疗效考核价值。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。     

华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子的分子生物学及免疫学定位研究

目的由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究。方法生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法。结果由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了csRPEF（RNA聚合酶Ⅱ延长因子）基因。通过BLASTX程序同源性比对,显示CsRPEF基因与小鼠和人类的RPEF基因同源性为82％。成功构建了CsRPEF原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行了大规模诱导表达,所表达的GST融合蛋白经蛋白酶原切割后获得CsRPEF重组蛋白。凝胶扫描分析和Bradford法显示,CsRPEF重组蛋白的纯度和浓度分别为85％和（0．73±0．02）mg／ml。将CsRPEF重组蛋白接种至BALB／c小鼠进行免疫实验。间接ELISA法显示免疫小鼠抗体滴度达1：150。免疫识别结果显示此抗体可识别20ku CsRPEF重组蛋白和华支睾吸虫20ku虫源性蛋白。S-P免疫组化方法显示CsRPEF主要定位于华支睾吸虫成虫的表皮、皮下组织和虫卵三部位。CsRPEF新基因序列GenBank的登录号为EU232119。结论CsRPEF基因是防治华支睾吸虫病生物药物研发的重要靶点。     

华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段原核表达及其抗原性分析

目的 通过克隆和表达获得华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段重组蛋白并分析其抗原性。方法 以pET-28a-CsCP1-3重组质粒为模板进行目的片段CsCP1a-3a PCR扩增,构建pET28a-CsCP1a-3a表达载体,并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析;表达产物经变性、纯化及复性,与华支睾吸虫感染大鼠血清行Western blot分析。结果 成功构建pET28a-CsCP1a-3a重组质粒;SDS-PAGE分析显示,重组蛋白CsCP1a-3a以包涵体形式表达;重组蛋白CsCP1a-3a可被华支睾吸虫感染后第4、5周大鼠血清识别。结论 重组蛋白CsCP1a-3a具有较好抗原性,可作为华支睾吸虫感染诊断候选分子。