褐黄血蜱组织蛋白酶L的克隆和表达水平分析北大核心CSCD

目的对褐黄血蜱组织蛋白酶B(cathepsin L-like cysteine proteinase B,cathepsin L-lcp B)基因进行克隆及表达分析。方法基于褐黄血蜱唾液腺转录组文库中的Contig731序列设计引物,RACE法扩增cathepsin L-lcp BcDNA(Hf-CLlCPb)全长,qPCR法分析Hf-CLlCPb在不同吸血状态下雌成蜱不同组织的表达水平。结果Hf-CLlCPb全长1547bp,ORF框长1005bp,编码355个氨基酸;该基因在半饱血、饱血褐黄血蜱(♀)中的唾液腺表达量最高,卵巢、中肠、体壳次之;Hf-CLlCPb在半饱血褐黄血蜱(♀)中的表达量高于饱血褐黄血蜱(♀)。结论成功克隆出褐黄血蜱Hf-CLlCPb基因全长,qPCR检测Hf-CLlCPb基因在褐黄血蜱唾液腺中高表达。     

镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA文库的构建

目的 为了筛选抗蜱及蜱传疾病基因工程疫苗的抗原候选分子,构建了镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA表达文库。方法 用Frizol试剂提取镰形扇头蜱半饱血雌蜱总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用长链PCR(LD-PCR)扩增方法,合成双链cDNA。双链cDNA(ds cDNA)在Sfi I内切酶的作用下,形成两端分别带有Sfi I A和Sfi I B的粘性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集500bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有Sfi工A和Sfl I B末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA噬菌体表达文库。结果 经测定,库容量为4.2×106,重组率为96％。扩增后的文库滴度为2.04×1010pfu/ml。通过对文库中随机挑选的15个克隆进行序列分析,获得一个编码线粒体ATP酶第6亚基蛋白的全长cDNA序列。结论 结果显示,镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA表达文库已构建成功。     

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因GP15的克隆和分析

目的 通过扩增Ha7．7，获得包含该EST的基因全长，以便研究该基因的生物学功能。方法 以Ha7．7-GSP-和Ha7．7-GSPz和Ha7．7-GSP。为引物，RACE法扩增亚洲璃眼蜱雌成蜱唾液腺总RNA，获得基因的5’-端。根据Ha7．7和5’-端序列设计全长引物（Ha7．7-FLP^＋和Ha7．7-FLP-），扩增cDNA第1链获，得全长cDNA。结果 分析表明，基因大小为449bp，由吸血诱导亚洲璃眼蜱成蜱唾液腺表达。结论 与数据库资料比对显示，GP15为新纪录（Genbank登录号DQ020265）。     

长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的构建及免疫学筛选

目的 构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,筛选长角血蜱功能性抗原基因。 方法 在无RNA酶污染的条件下提取长角血蜱总RNA,进而纯化mRNA,以寡脱氧胸腺核苷酸［oligo（dT）］为引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将cDNA分子定向克隆至具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体。用噬菌体包装蛋白对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转化大肠埃希菌（Escherichia coli）ER1647,从而构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库。使用兔抗长角血蜱全蜱血清对该文库进行免疫学筛选,经过2次筛选得到的阳性噬菌体转化E. coli BM25.8亚克隆为重组质粒,转化E. coli JM109,提取重组质粒进行PCR和测序分析。 结果 长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的基础库容量为1.8×106 pfu,重组率为100%,扩增后的滴度为2.4×109 pfu/ml。筛选获得42个阳性克隆,序列分析表明有12个新cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱原肌凝蛋白、环状扇头蜱幼蜱未知蛋白、黑腹果蝇染色体2R、褐黄血蜱线粒体DNA、青海血蜱HqL09、Hq05和肌球蛋白轻链mRNA等具有同源性。 结论 构建了长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,获得的阳性克隆为长角血蜱功能性抗原的研究奠定基础。     

家蝇几丁质酶MDCht2基因的序列分析、克隆与表达模式分析

目的从家蝇的基因组库中筛选几丁质酶2(MDCht2)基因,进行cDNA克隆及分子特性分析,对其时空表达模式进行初步探索。方法从家蝇基因组数据库中筛选MDCht2基因,以该基因的cDNA为模板进行PCR扩增,采用生物信息学相关软件对MDCht2基因及其编码蛋白质的基本理化性质、信号肽、蛋白质结构等进行分析,预测蛋白质功能。取家蝇不同生活史时期(卵,1龄幼虫,2龄幼虫,3龄幼虫,蛹,雌雄成虫)及3龄幼虫不同组织(体壁,气管,马氏管,唾液腺,脂肪体,肠道)标本,采用实时荧光定量PCR检测MDCht2基因表达情况。结果 MDCht2基因cDNA全长1 932 bp,ORF框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,理论相对分子质量为57.8×10~3,pI 5.67,属于亲水性的酸性蛋白,有信号肽,功能结构域位于第37～385位氨基酸间,无几丁质结合域。二级结构分析显示存在无规则卷曲(Cc),α螺旋(Hh),β折叠(Ee)3种类型。PCR扩增得到MDCht2基因长为1 530 bp的序列片段。实时荧光定量PCR检测家蝇MDCht2基因在蛹期的表达量较卵期上调6.477 01倍(P0.01),3龄幼虫表达量上调2.655 25倍(P0.01),1龄幼虫的表达量上调2.475 01倍(P0.05),表达水平排列顺序为蛹3龄幼虫1龄幼虫2龄幼虫卵雄成虫雌成虫。以体壁为参照,MDCht2基因在家蝇气管中的表达量较高,气管中的表达量较体壁上调1.816 51倍(P0.01),表达水平为气管体壁唾液腺脂肪体肠道马氏管。结论成功克隆了家蝇的MDCht2基因并初步探索了其时空表达模式,即MDCht2基因在蛹期及气管组织高表达,为MDCht2的功能研究奠定了基础。     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

嗜人按蚊雌蚊差异表达基因的鉴定及全长cDNA的克隆

目的鉴定和克隆嗜人按蚊雌蚊差异表达基因并对基因序列进行分析。方法以嗜人按蚊为试验模型,根据差异表达基因EST序列(GenBankTM接受号:EX916923)设计引物,采用实时定量PCR(real-time PCR)和RACE(rapid amplifica-tion of cDNAend)技术对雌蚊差异表达基因进行鉴定并扩增其cDNA序列。结果利用F=2-△△CT公式计算出雌蚊差异表达基因在雌蚊和雄蚊中的表达比值为267.49;差异表达基因全长mRNA序列为364bp,开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列经BLAST分析与致倦库纹(Culexquinque fasciatus)结构蛋白(tectin)及其他物种蛋白序列具有相似性。序列发送至NCBI获得接受号:FJ907236。结论该基因为雌蚊差异表达的基因,其全长mRNA序列的获得为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果本研究获得了一个编码日本血吸虫Argo-naute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Real-time PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增

目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的克隆表达和蛋白纯化

目的原核表达华支睾吸虫鳞状上皮癌相关肿瘤基因(SCCRO)全长编码区序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做好准备。方法用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA文库中识别出与人鳞状上皮癌相关基因的同源序列及其全长编码区,将其编码区序列克隆到原核表达载体PET-30a(+),测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,重组产物用His-镍蛋白纯化柱纯化。结果华支睾吸虫鳞状上皮癌相关基因长度为1 218bp,其全长编码序列长度为780bp,编码259个氨基酸,1-22位为分泌信号肽,在羧基端有一个高度保守的区域。该基因在大肠杆菌中得到了高效的可溶性表达,重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度可达98%。结论鳞状上皮癌相关基因的PET-30a(+)原核重组质粒在大肠杆菌BL-21/DE3中可以稳定高效地表达可溶性蛋白。     

肝细胞癌高表达基因片段P02的全长RACE扩增和序列分析

目的扩增肝细胞癌高表达基因基因P0 2的全长cDNA序列,并利用生物信息学知识对其进行分析,为进一步研究该基因在肝细胞癌发生、发展中的作用奠定基础。方法运用SMARTRACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技术扩增P0 2的5’和3’末端cDNA ,对RACEPCR产物作TA克隆,碱裂解法抽提阳性克隆质粒,酶切和PCR验证目的片断的插入,Sanger双脱氧链中止法测序,利用BLAST、基因探索者等生物学软件对序列进行分析、拼接,获得全长cDNA ,利用在线预测软件预测该基因的生物学功能。结果获得865bp的全长cDNA序列,其开放读码框长172个氨基酸,与TPT1基因高度同源,是一个生理功能尚未完全明了、与生长相关的蛋白质,蛋白质结构和功能预测提示该基因产物可能是一个位于细胞膜的与生长相关的裂解酶。结论在肝细胞癌组织中成功克隆扩增了长865bp的P0 2全长cDNA序列,为进一步功能研究奠定基础。     

锡兰钩虫HPI基因的原核表达与生物信息学分析

目的 克隆表达锡兰钩虫血小板抑制剂(hookworm platelet inhibitor, HPI)基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法 以锡兰钩虫cDNA 为模板,参考已公布的犬钩虫血小板抑制剂(AcaHPI)基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR 扩增其AceHPI基因序列,并将其连接至pET-28a表达载体,诱导其表达并纯化。利用在线软件对其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比对和生物信息学分析。结果 锡兰钩虫AceHPI基因的ORF序列全长603 bp,编码200个氨基酸,与犬钩虫AcaHPI氨基酸序列同源性为91%。构建的重组表达质粒pET28a-AceHPI经诱导表达与纯化,获得了分子质量约为26 kDa的可溶性融合蛋白。预测分析表明该蛋白为疏水蛋白,前17个氨基酸为信号肽序列且无跨膜结构域。结论 成功克隆表达了AceHPI基因并对其编码氨基酸进行了生物信息学分析,为进一步研究AceHPI在感染宿主体内的作用机制奠定了基础。     

家蝇抗真菌肽-1的cDNA克隆及其编码蛋白序列的生物信息学分析(英文)

目的克隆家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)的cDNA序列并对其编码的蛋白序列进行生物信息学分析。方法根据MAF-1的N端30个氨基酸序列设计简并引物,采用RACE法和巢式PCR技术克隆MAF-1的3′端和5′端cDNA序列,获得MAF-1的cDNA序列和氨基酸序列。根据所得MAF-1成熟肽部分的cDNA序列设计引物进行RT-PCR,对序列进行验证并运用生物信息学软件进行分析。结果 MAF-1的3′端cDNA序列长度为568bp,开放阅读框长度为441 bp,编码蛋白序列共147个氨基酸,3′端非编码区127bp。经NCBI中Blast比对未找到同源序列,提示该基因为一全新序列,登录到GenBank,获得登录号HM178948。该基因编码的147个氨基酸加上MAF-1的N端未用来设计引物的9个氨基酸,全长共156个氨基酸。由5′RACE获得139 bp cDNA序列,分析所得MAF-1成熟肽的氨基酸序列与前述一致。RT-PCR结果证实了RACE所得MAF-1序列的正确性。根据生物信息学分析方法对所推导的MAF-1蛋白全长序列进行分析,其理论相对分子质量和等电点均与其实际检测值相近。利用ExPASy的各种分析工具对M...     

疟疾传播媒介斑须按蚊唾液腺cDNA表达基因库的构建及原基因的筛选

目的为寻找编码按蚊唾液腺分泌性蛋白质的基因.方法应用RNeasy试剂盒提取斑须按蚊唾液腺总RNA;OrientExpressTMOligo(dT)cDNALibraryConstruction系统反转录合成双链cDNA,修饰后加上EcoRⅠ/HindⅢlinker,经酶切、大小分馏后,与λSCREEN-1臂相连,体外包装为λ噬菌体颗粒,构建成cDNA表达文库;在感染大肠杆菌ER1647后,检测cDNA表达文库的大小;应用兔抗唾液腺蛋白血清对部分文库进行免疫筛选,并将含cDNA片段的阳性λSCREEN克隆株转化成pSCREEN质粒,经EcoRⅠ/HindⅢ消化后,分析cDNA片段.结果cDNA表达文库容量为4×106/pfu.应用抗唾液腺蛋白血清筛选,获得3个阳性克隆株,酶切后cDNA片段的长度约为500pb.结论已筛选到与抗唾液腺蛋白的免疫血清反应的阳性克隆株,而且获得编码唾液腺蛋白抗原的基因片段,并将其转入pSCREEN质粒中,为进一步研究蚊唾液腺内编码分泌性蛋白质基因的作用奠定了基础.     

人1igatin样基因HCA56的克隆及其生物信息学分析

目的 利用SEREX方法筛选人肝细胞癌(HCC)cDNA表达文库，克隆能引起机体体液免疫应答的抗原编码基因，并对其进行生物信息学分析，以指导对新克隆基因功能的研究。方法采用ZAP—cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning试剂盒构建人HCC cDNA表达文库，用患者自体血清进行筛选，对筛选得到的阳性克隆进行序列测定。通过生物信息学对筛选得到的阳性克隆HCA56进行染色体定位、基因结构分析、蛋白序列预测以及相似性搜索和功能分析。逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)检测HCA56的组织表达谱。结果 通过对一个cDNA表达文库的筛选，获得了一个血清反应阳性克隆HCA56，全长2021bp，编码584个氨基酸，定位于染色体1q31～q32。数据库搜寻表明它与人ligatin编码基因片段有95％的相似性。RT—PCR显示HCA56广泛分布于各种正常组织。结论 HCA56很可能是ligatin的全长编码基因，生物信息学与分子生物学相互结合是进行新基因研究的有效方法。     

间日疟原虫网织红细胞结合蛋白-2(PvRBP-2)与PvRBP-1及约氏疟原虫235kDa棒状体蛋白家族具有共同结构特征

作者先前已发现了间日疟原虫网织红细胞结合蛋白PvRBP-2与PvRBP-1,并报道了PvRBP-1的氨基酸序列与其全长编码基因,以及编码PvRBP-2的3.7 kb基因片段。本文作者对λZAP文库gDNA与cDNA进行了序列杂交扫描,以此方法得到了PvRBP-2基因的其余序列。新的下游序列约1300 bp,包括编码序列、TAA终止子以及约600 bp的3’端非翻译区。cDNA 18.1克隆被认为     

微小牛蜱磷酸丙糖异构酶基因片段的克隆与原核表达

为克隆和表达微小牛蜱磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,Tim)编码基因,提取微小牛蜱成虫总RNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其连入pMD-18T载体,经酶切和测序鉴定后,将正确的目的基因与pET-28a表达载体连接,并转入大肠埃希菌(E.coli)Rosetta(DE3)中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分析。结果发现,克隆所得的微小牛蜱成虫tim基因片段长度为750bp(登录号为JX112888),其中开放阅读框为750 bp,编码249个氨基酸,与微小牛蜱胚胎中克隆出的tim基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Tim相对分子质量(Mr)约为27 000。     

白纹伊蚊唾液腺serpin1基因的可变剪接分析与原核表达

目的 克隆并原核表达白纹伊蚊唾液腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因1（Aalbserpin-1）.方法 根据NCBI网站上白纹伊蚊Aalbserpin-1（AY826096.1）的序列设计引物,用RT-PCR从白纹伊蚊广州株中获取Aalbserpin-1全长基因序列,并进行生物信息学分析.将目的片段克隆到原核表达载体pET28a（＋）,转化到大肠杆菌中诱导表达.利用实时荧光定量RT-PCR分析Aalbserpin-1_2基因在白纹伊蚊不同组织中的表达差异.结果 PCR扩增获得Aalbserpin-1基因两个转录本（Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2）,Aalbserpin1_1的基因序列为1 260 bp,编码419个氨基酸;Aalbserpin1_2的基因序列为1 332 bp,编码443个氨基酸,均具有seprin结构域,Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2与Aalbserpin-1（AY826096.1）相比,相似性分别为95％和90％.两个转录本比较,Aalbserpin1_2中含有24个氨基酸的可变剪接子正好位于其功能活性中心环（RCL）上.以Aalbserpin1_2序列为模板,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒.SDS-PAGE结果显示目的基因在Ori-gami（DE3）中表达,重组蛋白相对分子量（Mr）约为50 000 Da,经亲和层析获得目的蛋白.组织表达谱显示Aalbserpin-1_2在唾液腺（SG）、中肠（MG,P＞0.05）丰富表达,脂肪体低表达（FB,P＜0.05）.结论 白纹伊蚊广州株Aalbserpin-1基因具有两个可变剪接子,其中Aalbserpin-1_2在唾液腺、中肠丰富表达,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒并获得重组蛋白.