逆转录病毒介导的牛生长激素基因转染NIH3T3细胞和人胚肺成纤维细胞

目的：以牛生长激素(bGH)为模型，建立逆转录病毒载体转移系统，体外转染鼠成纤维细胞株NIH3T3和人胚肺成纤维细胞2BS，以获得bGH表达。方法：将PCR扩增的bGH基因片段插入逆转录病毒载体pSXLC-MDR相应酶切位点，获得的重组逆转录病毒质粒。应用脂质体方法转洒重组质粒进入包装细胞PA317，筛选长春新碱抗性克隆株，收集上清液感染NIH3T3细胞和人胚肺成纤维细胞2BS，筛选携带bGH基因的成纤维细胞的克隆株3T3／bGH和2BS／bGH。结果：RT－PCR分析表明基因转染组的3T3／bGH细胞和2BS／bGH细胞在相当于680bp处有一清晰的条带，而空质粒对照组无相应条带出现。RIA分析表明转染基因细胞的培养液及胞浆蛋白有bGH蛋白表达，而作为对照的3T3／mdr细胞和NIH／3T3细胞均无此蛋白表达。结论：应用逆转录病毒IRBS载体系统转染bGH基因进入成纤维细胞，该系统易筛选，转染效率较高。     

痘苗病毒-汉滩病毒疫苗能保护仓鼠抵抗汉滩和汉城病毒的攻击

作者构建了能表达汉滩（HTN）病毒M和S片段产物的重组痘苗,这种疫苗能诱导     

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达

用ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ酶切，获得人碱性成纤维细胞生长因子基因，将该基因插入原核高效表达载体ＰＢＶ２２０的ＰＬＰＲ启动子下游，获得重组质粒ＰＢＶ－ＦＧＦ，转化大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃诱导使重组子表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ、ＭＴＴ活性检测结果表明，该重组菌能够表达具有生物活性的ｈｂＦＧＦ。     

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.     

Geldanamycin产生菌生物合成相关基因的克隆与分析

目的：从geldanamycin产生菌吸水链霉菌（S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因，为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础。方法：以链霉菌／大肠埃希氏菌穿梭cosmids pKC505为载体构建了插入片段为20－30kb的S.hygroscopicus总DNA文库，以利福霉素中与3－氨基－5－羟基苯甲酸（AHBA）合成相关基因为探针，经菌落杂交，Southern杂交筛选同源基因片段，测序结果与Genbank进行同源性比较分析，并以attp-噬菌体载体KC515利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定。结果：构建的基因文库含重组基因比率高，基因组覆盖率高，稳定性好，经同源基因探针杂交，从文库中筛选出9个阳性cosmids克隆pCGB20,pCGB26,pCGB28,pCGB29,pCGB36,pCGB45,pCGB49,pCGB63,pCGB75，测序分析表明，cosmid pCGB20中BamHI-BamHI 8kb片段两端的不完整ORF编码蛋白与竹桃霉素（oleandomycin)PKS Module 5,Module 6(一致性为79％）和红霉内酯合成酶ORF2（一致性为75％），ORF1（一致性为73％），ORF3（一致性为70％），高度同源；BamHI-BamHI 3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的DNA有同源性，该家族与AHBA合成酶关系密切，Cosmid pCGB20的BamHIBamHI 8kb及BamHI-BamHI 3kb基因片段已通过基因阻断实验初步鉴定，证明它们参与geldanamycin生物合成，而其他cosmids阳性克隆的序列分析及功能研究尚在进行中。     

地塞米松抑制转化生长因子βl对人αl（I）前胶原基因的转录激活

目的探讨地塞米松与转化生长因子β1(TGFβ1)之间的相互作用及对人α1(I)前胶原基因启动转录的影响。方法人皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用FuGENE转染试剂，分别瞬间转染含人α1(I)胶原基因5’侧翼序列—2．5KB与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phOOL2．5至人皮肤及瘢痕成纤维细胞。ELISA法测定地塞米松及TGFβ1作用24h后，转染了phOOL2.5的2种成纤维细胞的报告基因CAT表达量。结果地塞米松能抑制转染了pHOOL2．5重组体的人皮肤及痴痕成纤维细胞CAT表达量，且能拮抗TGFβ1对转染了pHOOL2．5重组体的2种成纤维细胞CAT表达的上调作用(P＜0．05)。结论在正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中，地塞米松均能抑制人α1(I)前胶原基因的启动转录，且能拮抗冗TGFβ1对人α1(I)前胶原基因的转录激活。     

大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

干扰素的临床应用

1 干扰素的生物学基础 干扰素（IFN）的发现是基于两种病毒感染同一宿主细胞时出现的相互干扰现象。细胞内发生干扰现象的原因，是病毒诱导一种细胞基因（IFN基因）进行表达。而产生的一种非抗体性纸分子糖蛋白，可以干扰病毒的复制。IFN基因不同．其表达产物按分子结构和抗原性可分α、β、γ型，分别由白细胞、成纤维细胞和T淋巴细胞产生。在同一型内按氨基酸的差异再分亚型。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

超广谱-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达,为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,自行设计一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断,定向克隆入质粒载体pBK-CM V构建重组质粒,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后,N itrocefin显色结合SDS-PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带,定向克隆入质粒载体pBK-CM V后筛选到大小约为5.4kb的重组质粒,S acⅠ和E coRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段,DNA测序发现插入片断的基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对n itrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

冠心病缺血性ST段变异规律及其临床意义

我们利用动态心电图(Ambulatery Electrocardiography,AECG)对本院83例确诊冠心病(CoronaryAtery Disease,CAD)病人做AECG检测,发现缺血性ST段压低发作有明显的时辰节律,上午6-12时为发作高峰,与急性心梗(Acute Myocardial Isehemia AMI)猝死(Sudden Death,SD)发生的时相高峰期相符,故认为ST段的24小时周期性变异规律是AMI、SD等意外心脏事件发作、治疗重要的预防因子,同时为探讨心肌缺血机理、改善心肌缺血方面研究提供客观依据。     

短节段弹性内固定治疗腰椎不稳症效果观察

目的探讨弹性内固定治疗短节段腰椎不稳症的应用价值和实际疗效。方法2007年6月-2010年6月采用弹性内固定加椎间CAGE植骨融合治疗短节段腰椎不稳症33例。记录手术时间、失血量、植骨融合时间，随访观察相邻节段退变情况。根据侯树勋的疗效评定标准判定疗效。结果手术时间平均95min；术中出血平均250ml，术后无神经根损伤及脑脊液漏登并发症，随访平均18个月，X线片显示33例骨性融合，平均融合时间5个月，内固定无松动及折断，MRI显示所有的病变节段的相邻节段未出现退变或退变加重。末次随访时疗效评定：优30例，良2例，可1例。结论采用弹性内固定治疗短节段腰椎不稳症，可有效的进行腰椎后路减压融合、促进神经功能恢复，有效防止相邻节段退变。     

眼后段给药系统与给药技术

眼后段给药一直是困扰医药工作者的一大难题.随着新型给药系统与给药技术的发展,近年眼后段给药取得了令人瞩目的进步.植入剂、生物可降解微粒、脂质体等新型给药系统及电离子导入给药技术在眼后段疾病的治疗中具有广阔的应用前景.本文在检索国内外文献的基础上,综述眼后段给药的研究进展,包括治疗眼后段疾病的给药途径、新型给药系统及给药技术等.     

椎体后凸成形术对邻近节段的生物力学影响

目的 通过分析椎体后凸成形术对脊柱功能单位(FSU)的生物力学作用,探讨椎体后凸成形术对邻近节段的生物力学影响.方法 将16个胸椎FSU交替分配至两组,制成压缩骨折模型,对骨折椎体行椎体后凸成形术,分别用磷酸钙骨水泥(CPC)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥灌注.测量手术前后FSU强度和刚度,不同载荷下椎间盘、椎体和后部结构的应力、应变值以及椎间盘的位移值.结果 术后CPC组和PMMA组FSU强度较术前分别增加14%和16%,刚度分别减少13%和12%.两组FSU未强化椎体的应力应变值均高于术前(P＜0.05),CPC组未强化椎体应力应变值低于PMMA组(P＜0.05).两组FSU术后椎间盘位移比术前明显减少(P＜0.01),CPC组椎间盘位移值大于PMMA组(P＜0.01).结论 椎体后凸成形术增强了FSU的生物力学性能,但可促使邻近节段退变,改变灌注剂材料特性可以改善对邻近节段的影响.     

常见肺部楔形病变的多层螺旋CT诊断

目的 探讨慢性肺炎、肺结核和肺癌引起的肺段楔形病变的多层螺旋CT(MSCT)特点及诊断价值.方法 收集88例肺段病变的MSCT资料(30例慢性肺炎、24例肺结核、34例肺癌).全部经病理、痰检结核菌证实.重点观察病灶的外形、边缘、密度、支气管和邻近改变.结果 大多数肺段病灶均有2～3个以上的CT层面呈楔形或锥状(尖朝向肺门,底部位于肺外周),少数病灶需将各个层面叠加起来或经多平面重组技术(MPR)重建方呈锥形外观.慢性肺炎病灶边缘多稍内凹或平直,楔尖支气管通畅,未见结节;密度较均匀,可见支气管气相或支气管扩张;底部相邻胸膜增厚明显.结核病灶边缘常不规则或模糊;密度不均;楔尖未见结节,可有支气管狭窄;卫星病灶和胸膜增厚较多见.肺癌病灶边缘可见外凸;密度均匀或较均匀;楔尖支气管阻塞和结节.诊断正确率82%.结论 三种肺段病变MSCT表现有一定特点,诊断时须综合分析各种征象.不典型病例的诊断有赖于病理.     

Synthesis and conformation of the trimeric coiled-coil segment of laminin*

A disulfide linked 95-mer parallel hetero-trimeric active site segment of laminin was designed and synthesised. The three subunits, A (32-mer), B1 (30-mer) and B2 (33-mer), were prepared by Boc-based solid-phase peptide synthesis involving a two-step trimethylsilyl bromide-thioanisole and HF deprotection procedure. The interlinking of the three subunits was accomplished by the stepwise selective formation of two disulfide bridges using air-oxidation and thallium (III) trifluoroacetate oxidation. The conformations of the synthetic peptides were studied by circular dichroism (CD) spectroscopy, showing that the hetero-dimer, B1-B2, one of the homo-dimers, B1-B1, and the trinier are 30 to 40% in the α-helical conformation in aqueous buffer. Variable temperature CD studies demonstrated that the trimer is considerably more stable (melting temperature (Tm) = 61°) than the hetero-dimer, B1-B2 (Tm = 36°).     

腰椎融合术后邻近节段退变的临床观察

目的探讨腰椎融合术后邻近节段退变的特点,以及再手术治疗的术式及疗效.方法回顾性分析2001年1月至2004年12月我科收治的行腰椎融合术的患者,其中发现18例患者出现了邻近节段退变.采用返修手术对18例患者进行手术处理,将减压及固定融合范围向邻近退变节段延伸,缓解临床症状.按照候树勋等的临床疗效评价标准随访观察.结果经过12.1个月(7～36个月)的随访,优良率88.9%.有1例患者于再次手术后4个月出现内固定松动脱落,再次手术取出内固定.结论退变好发于融合节段的上方,应仔细鉴别症状复发是由于前次手术节段引起还是邻近节段退变引起.必要时再手术治疗仍可取得较好的疗效.