稳定高表达增强型绿色荧光蛋白基因膀胱癌细胞株的构建

目的 建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的膀胱癌细胞株(KU-7/EGFP)并观察其生物特性的变化.方法 利用脂质体将EGFP真核表达质粒(pEGFP-N3)转染至人膀胱癌细胞株KU-7,经过G418筛选和克隆化培养,荧光显微镜及流式细胞仪观察转染EGFP基因的KU-7在裸鼠体内外的表达情况,分析转染细胞生物学行为变化.结果 KU-7/EGFP在荧光显微镜下发出绿色荧光,能稳定、高效和持久地表达EGFP,与未转染细胞比较,其生物学特性未改变.KU-7/EGFP接种于裸鼠皮下5 d后成瘤,14 d后肿瘤直径达到15 mm.结论 成功建立了稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞株KU-7-EGFP,其生物学特性未变.     

脂质体介导转染的绿色荧光蛋白基因在骨髓基质细胞内的表达

目的研究脂质体转染法对骨髓基质细胞进行基因修饰的可行性。方法在体外分离和扩增大鼠骨髓基质细胞,用脂质体转染法介导绿色荧光蛋白基因进入到骨髓基质细胞内,荧光显微镜下检测荧光蛋白的表达,台盼兰排斥试验检测转染细胞的活力。结果绿色荧光蛋白可以在大鼠骨髓基质细胞内表达,转染效率为(28.9±3.6)%;脂质体法转染后的细胞活力为(93.6±4.8)%。结论脂质体转染法可以介导外源基因进入到骨髓基质细胞内表达。     

应用基因转染方法调节HSP70在人胃癌细胞株SGC7901中的表达

目的　为探讨 ＨＳＰ７０ 在人胃癌中过度表达的意义, 调节ＨＳＰ７０ 在人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１ 中的表达．方法　应用脂质体介导的基因转染方法,将表达针对ＨＳＰ７０的反义ＲＮＡ 表达载体及ＨＳＰ７０ 表达载体转入ＳＧＣ７９０１ 细胞,通过ｈｙｇｒｏ ｍ ｙｃｉｎｅ 抗性筛选, 挑选阳性克隆;对阳性克隆从ＲＮＡ 水平（ 点杂交及ＲＮａｓｅ 保护试验） 及蛋白质水平（ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 及免疫组化） 进行研究．结果　ＨＳＰ７０ 在转染细胞中的表达得到了调节． 为进一步研究ＨＳＰ７０ 对胃癌形成与发展的作用创造了条件．结论　经过ＨＳＰ 反义或正义ＲＮＡ 转染的ＳＧＣ７９０１ 细胞具有不同的ＨＳＰ７０ 表达水平可用于胃癌发生机制的研究．     

绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞

目的 建立以增强型绿色荧光蛋白基因示踪骨髓间质干细胞的方法。方法 采用密度梯度离心法分离、培养免骨髓间质干细胞，以脂质体介导法转染增强型绿色荧光蛋白基因的表达质粒，荧光显微镜观察基因表达及转染效率。结果 绿色荧光蛋白在基因转染12h后开始表达，48～72h达高峰，并在1周内有较强的表达，以后逐渐减弱，4周左右仍有少量表达，转染效率与质粒、脂质体的浓度有关，外缘基因导入后不影响骨髓间质干细胞的生长和增殖。结论 脂质体介导的绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞后能安全、有效地表达，转染效率为20％～30％，是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )-GFP，并观察其在Hep2细胞中的表达情况。方法据已知的EGFP基因序列，设计合成1对引物，并引入HindⅢ和EcoR V酶切位点。应用PCR技术，从含有EGFP的pAdTrack-CMV中扩增EGFP编码基因。通过TA连接将其克隆人pGEM-T easy载体，经PCR及限制性内切酶鉴定后，插入真核表达质粒pcDNA3．1( )中，转化Escherichia coli DH50感受态细胞，于Amp^ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经HindⅢ和EcoR V双酶切、PCR鉴定，将该载体转染入喉癌细胞Hep-2后48h观察EGFP表达情况。结果 成功构建了含EGFP编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )GFP，并成功转染Hep2细胞，在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。结论 获得可产生绿色荧光的EG-FP，能方便地用作报告基因和筛选标记。     

pEGFP-rhPLD_2融合基因在CHO细胞株中的稳定表达

目的建立可以稳定表达增强型绿色荧光蛋白-重组人磷脂酶D2(pEGFP-rhPLD2)的CHO细胞株,从而制备大量的重组PLD2(rhPLD2)蛋白,为rhPLD2的功能研究奠定基础。方法用脂质体介导pEGFP-rhPLD2重组质粒转染CHO细胞株,经G418加压筛选出阳性克隆,用RT-PCR、Western blot检测pEGFP-rhPLD2融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达。结果pEGFP-rhPLD2融合基因整合入细胞基因组DNA中,成功建立了pEGFP-rhPLD2在CHO细胞中的稳定表达体系。结论获得了稳定表达pEGFP-rhPLD2的CHO细胞株,为进一步研究rhPLD2的生物学功能及其在疾病预防治疗方面的作用奠定了实验基础。     

绿色荧光蛋白-CCNG2表达载体的构建及鉴定

目的为进一步探讨细胞周期蛋白G2（CCNG2）基因功能奠定基础。方法以成人脑cDNA文库为模板,PCR扩增人CCNG2基因,In-Fusion技术定向克隆到pENTR1A中,酶切测序鉴定后重组到pcDNA6.2TM/EmG-FP-DEST Gateway载体,构建pcDNA6.2-EmGFP-G2。将鉴定正确的质粒瞬时转染人舌鳞癌细胞Tca-8113,24 h后观察,定量PCR检测CCNG2 mRNA表达。结果扩增得到1 032 bp的基因片段,经测序验证与GenBank中人CCNG2序列相符;pcDNA6.2-EmGFP-G2经酶切和测序鉴定无误。转染Tca-8113后,荧光信号除在胞质中表达外,在部分细胞的胞核DAPI染色弱信号区浓聚。转染该重组质粒后CCNG2 mRNA表达水平显著增高。结论成功构建了以绿色荧光蛋白作为报告基因的CCNG2表达载体,为进一步研究CCNG2基因功能奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的　构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。　方法　据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。　结果　成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。　结论　获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。     

绿色荧光蛋白基因在骨髓基质细胞内表达的意义

在体外分离和扩增大鼠骨髓基质细胞,用脂质体转染法介导绿色荧光蛋白基因进入骨髓基质细胞内,荧光显微镜下检测荧光蛋白的表达,台盼蓝排斥试验检测转染细胞的活力。结果绿色荧光蛋白在转染大鼠骨髓基质细胞24h后开始表达,48~96h表达最强,转染效率为(28.9±3.6)%;然后逐渐降低,2周后仍可见少量表达。提示外源基因可以在骨髓基质细胞内高效表达。     

逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:观察逆转录病毒介导绿色荧光蛋白基因在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)中的表达,为干细胞移植机制的研究提供基础.方法:采用密度梯度离心法分离培养BMSCs,诱导培养液诱导其向成脂肪方向分化,行细胞表面抗原鉴定,及油红O染色评价细胞成脂肪情况.在此基础上,采用逆转录病毒pLEGFP-N1对细胞进行荧光蛋白标记,观察细胞形态学改变荧光表达的时间与强度,计算转染率.结果:细胞扩增迅速,形态良好,纯度较高,经诱导后细胞内可见脂滴.逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,并对4 wk体外培养进行了良好的标记.结论:逆转录病毒pLEGFP-N1转染效率高,转染成功的BMSCs可以长期稳定表达目的基因,是一种理想的病毒载体.     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

胃癌组织中Ptc蛋白的表达变化及意义

目的观察胃癌组织中Ptc蛋白的的表达情况,并探讨其与胃癌分化和转移的关系。方法采用West—ern—Blot法检测15例胃癌患者肿瘤和癌旁组织中的Ptc蛋白。采用免疫组化SP法检测45例胃癌患者肿瘤组织标本中的Ptc蛋白,并分析其与胃癌临床病理参数的关系。结果胃癌组织中Ptc蛋白表达量为0．375±0．117,低于癌旁组织的0．697±0．158,P〈0．05。胃癌组织中Ptc的表达水平与肿瘤组织分化程度、临床分期和远处转移有相关性（P均〈0．05）。结论胃癌组织Ptc蛋白表达降低,其与胃癌分化与转移程度密切相关。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建及鉴定

目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体,为研究其抗肿瘤功能奠定基础。方法提取基因组RNA,利用特异性引物进行RT-PCR反应,扩增全长TSLC1基因片段,与真核表达载体pReceiver-M29载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增,以获得重组载体,应用酶切、PCR及测序鉴定此重组载体。结果RT-PCR获得约1 329 bp大小的特异性TSLC1基因片段;测序鉴定证实,TSLC1基因片段正确插入真核表达载体pReceiver-M29中。结论成功构建了真核表达载体pReceiver-M29-TSLC1。     

树突状细胞转染绿色荧光蛋白基因后生长特性和表型的变化

目的:绿色荧光蛋白(EGFP-N1)标记树突状细胞.示踪树突状细胞的生长并研究EGFP-N1对其表型表达的影响.方法:将EGFP-N1质粒转化入感受态菌DH5α中扩增,经BamHⅠ酶切鉴定后大量扩增,再提取并纯化质粒将其转染入树突状细胞,通过荧光显微镜和示踪转染前后树突状细胞的生长及表型表达的变化.结果:采用该方法可以获得纯度高的绿色荧光蛋白质粒,经过培养得到了形态典型的树突状细胞.质粒绿色荧光蛋白能够在人树突状细胞中长期稳定表达,转染后细胞表面标志CD80(81.90±2.44 vs 74.52±1.40),CD86(81.49±3.24 vs 78.61±1.64),CDla(37.42±3.25 vs 18.56±2.36)的表达量明显高于未转染细胞(均P<0.05).但是转染后细胞活性低于未转染细胞活性(67.41±3.17 vs 95.10±2.20,P<0.05).结论:绿色荧光蛋白能够示踪树突状细胞的生长及变化过程,为进一步研究肿瘤复发转移及治疗提供了一种简便的新方法.     

Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定

目的: 构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.方法: 设计人FADD特异性引物, 从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA, 通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA, 定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1. 应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定, 确认后转染人结肠癌细胞SW480.G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆,应用Western blot检测FADD的表达水平.结果: 测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因, FADD基因正确插入pEGFP-N1中, 在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达, Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高, 是未转染细胞的2.34倍.结论: 成功构建真核表达载体pEGF P-N1-FADD, 并且在SW480细胞中稳定表达.     

胃癌组织中微管聚合蛋白的表达及意义

目的探讨胃癌组织中微管聚合蛋白（Tau蛋白）的表达及意义。方法分别采用RT—PCR法和免疫组化法检测60例胃癌组织（观察组）和10份正常胃组织（对照组）中TaumRNA和蛋白表达情况。结果观察组TaumRNA和蛋白表达明显高于对照组（P均〈0．05）;胃癌组织中高中分化者TaumRNA和蛋白的表达明显低于低分化者,无淋巴结转移者明显低于有淋巴结转移者（P均〈0．05）。结论Tau蛋白与胃癌的发生、发展过程密切相关,可作为胃癌靶向治疗的靶点。     

荧光蛋白Venus载体构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建黄色荧光蛋白Venus重组载体,并观察其在哺乳动物细胞中表达情况.方法 将Venus克隆至限制性内切酶处理的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,转染293T细胞,荧光显微镜下观察结果.48 h后收集细胞蛋白,应用Western blot技术印证荧光蛋白Venus表达情况.结果 重组载体经限制性内切酶鉴定及测序比对正确,转染293T细胞后可见明亮荧光,弥漫分布于细胞质中,Western blot证明荧光蛋白Venus高量表达.结论 成功构建了Venus重组载体,荧光蛋白Venus在哺乳动物细胞中高表达,此为分子与细胞生物学提供了一种重要的研究工具.     

绿色荧光蛋白/PAP-a融合表达载体的构建及其在SMMG-7721细胞中的表达

目的构建绿色荧光蛋白/PAPa融合表达载体,并检则其在肝癌细胞SMMC7721细胞中的表达。方法采用PCR方法获得PAPa基因;将该基因片段克隆入带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,CFP)报告基因的真核表达载体pEGPN1中,构建融合表达载体pEGFPPAPa;通过脂质体介导的方法将该载体转染到SMMC7721中,Westernblot检测PAPa的瞬时表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果pEGFPPAPa转染SMMC7721细胞后,在细胞中检测到PAPa基因片段,Westernblot可以检测到PAPa在SMMC7721细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论pEGFPPAPa在SMMC7721细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有PAPa和绿色光蛋白的双重活性,该载体的成功表达是研究PAPa抗肿瘤或抗病毒活民生的基础。     

pEGFP-C3-hNIS重组质粒的构建及其在人胃癌BGC-823细胞的表达

目的构建人钠碘转运体（hNIS）基因真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并研究重组hNIS基因在人胃癌BGC-823细胞中的表达情况。方法采用Trizol一步法从甲状腺手术患者的甲状腺组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到hNIS的可编码区基因,并克隆到T载体上,测序后亚克隆到真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3的多克隆位点,获得重组真核表达载体pEGFP-C3-hNIS。分别将pEGFP-C3-hNIS重组质粒（实验组）和pEGFP-C3（对照组）瞬时转染至人胃癌BGC-823细胞中,转染48 h后,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达情况,并通过Western blot方法检测hNIS基因的蛋白表达水平。结果序列分析证实克隆片段与GenBank公布的hNIS基因序列（序列号：NM-000453）相似性达99.90%。转染48 h后,实验组与对照组细胞均可观察到较强绿色荧光信号,用hNIS基因特异性抗体检测表明实验组hNIS表达水平明显高于对照组。结论成功构建hNIS真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并能在人胃癌BGC-823细胞中高表达。