树突状细胞诱导的淋巴因子激活的杀伤细胞对肺癌细胞系A549的体外杀伤作用

目的:探讨负载肺癌抗原的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用.方法:采用肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)经rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a诱导和肿瘤冻融抗原刺激诱导获得的DC与LAK细胞按1:20比例共培养2 d,获得Ag-DC-LAK细胞作效应细胞,分别用Ag-Dc-LAK、DC-LAK、Ag-LAK和LAK对肺癌细胞系A549细胞进行杀伤实验.结果:以30μg/mL蛋白的肿瘤抗原负载的DC其表型CD1a、CD80、CD86、HLA-DR均显著升高(P<0.05),高于单纯细胞因子诱导成熟的DCs表型,由其刺激增殖的LAK细胞对肺癌细胞A549杀伤率为(71±5)%,明显高于对照组(P<0.05).结论:经肿瘤抗原刺激诱导成熟的DC可有效传递抗原,增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.     

脐血来源树突状细胞增强CIK细胞对肺癌细胞株的杀伤作用

目的探讨肺癌细胞株A549肿瘤冻融抗原负荷脐血来源树突状细胞(DCs)与CIK细胞混合培养后对A549细胞杀伤活性的影响作用。方法取对数生长期的A549细胞制备肿瘤抗原(Ag),用脐血单个核细胞(CBMC)分别制备DCs和CIK细胞;用负荷Ag的DCs和CIK细胞共培养,诱导Ag-DC-CIK细胞。用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测CBMC、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对A549肿瘤细胞株的杀伤活性。结果脐血DCs高表达CD86、CD40,中度表达CD83和CD80,低表达CD11c。实验组细胞(Ag-DC-CIK)对A549细胞的杀伤能力(62%)明显高于对照组(P<0.01),结论肿瘤抗原负荷的DCs能增强CIK细胞对靶细胞的杀伤活性,为DCs的免疫治疗提供了新的思路。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体内外抗肺癌的实验效应研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外对肺癌的影响。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM-CSF,IL-4及TNF-a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN-g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物,作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。用流式细胞仪分析细胞表型,自体混合淋巴细胞反应和异体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的的增殖活性。Cytotoxicity TOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性,同时用A549细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肺癌活性。结果在培养的第15d,与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23.4±2.3）倍vs（16.7±2.7）倍,P〈0.05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64.3±3.6）%vs（43.9±2.1）%,P〈0.05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强,体内实验显示,与单独培养的CIK细胞相比,与负载抗原的DC共同培养的CIK,可明显抑制接种瘤细胞的裸鼠成瘤率,DC＋CIK与负载抗原的DC＋CIK在抗六效应上没有明显差异。结论 DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK体内抗肺癌的活性。将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肺癌的实验研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外能否有效的抗肺癌。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM—CSF,IL-4及TNF—a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN—g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物．作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。CytotoxicityTOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性。结果在培养的第15d．与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23．4±2．3）倍vs（16．7±2．7）倍,P〈0．05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64．3±3．6）％vs（43．9±2．1）％,P〈0．05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强。结论DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK抗肺癌的活性．将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

树突状细胞疫苗对人肺腺癌GLC-82细胞体外杀伤作用的实验观察

目的 通过建立负载人肺腺癌细胞株GLC-82可溶性抗原的树突状细胞(DC)疫苗,探讨应用DC疫苗的致敏特异性杀伤性T细胞(CTL)体外杀瘤细胞的可行性和实验条件,为后期l临床应用提供实验依据.方法 通过用定量摩尔氯化钾提取法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽(TSA),从人外周血单核细胞(PBMC)中用GM-CSF、白细胞介素-4和肿瘤坏死因子-α体外诱导扩增并鉴定获取DC,构建DC疫苗;利用DC疫苗刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖,诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL的可行性及MTT法检测该CTL对GLC-82、肺癌CALU-6和人红白血病K 562细胞的体外杀伤效应.结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC,经形态学、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性;负载GLC-82抗原的DC疫苗能有效诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL,最适浓度为1:10;诱导活化的CTL对靶细胞的杀伤活性明显高于未经肿瘤抗原致敏的组.结论 诱导培养人外周血PBMC中的Mo可获取大量DC,诱导出的DC功能较强,适宜临床应用;DC疫苗能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD 8+表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应,对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应.     

肿瘤干细胞来源的DC-CIK 对同源肿瘤细胞的杀伤作用

【摘要】目的 观察干细胞负载树突细胞诱导的杀伤细胞（CSC-DC-CIK）作为效应细胞对同源肿瘤细胞的杀伤作用,探讨CSC 抗原参与肿瘤杀伤作用的可行性。方法 培养肾癌细胞株A498 和肺癌细胞株A549,用流式分选术分离纯化CD133+细胞,分别作为肾癌干细胞（KSC）和肺癌干细胞（LSC）,冻融法制备抗原。提取健康产妇脐带血的单个核细胞,体外扩增诱导生成DC 和CIK 细胞。分别用上述CSC 抗原负载DC,与CIK 共培养（CSC-DC-CIK）,流式细胞术分析DC 和CIK 细胞免疫表型,ELISA 法检测细胞因子分泌水平,用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测CSCDC- CIK 对同源肿瘤细胞的杀伤效率。结果CSC-DC 的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+及HLA-DR+的表达均高于单纯DC 的相应免疫表型的表达（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+ 及HLA-DR+的表达均高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的DC 免疫表型CD40+、CD80+、CD86+及 HLA-DR+的表达高于DC 与CIK 共培养后的相应免疫表型（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的CIK 免疫表型CD3+、CD8+、CD56+的表达高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的CIK 免疫表型CD3+、CD8+、CD56+ 的表达高于DC 与CIK 共培养后的CIK 相应免疫表型（P < 0.01）;DC、CSC-DC 与CIK 共培养后的IFN-γ、TNF-α和 IL-2 分泌水平高于共培养前（P < 0.01）;CSC-DC 与CIK 共培养后的IFN-γ、TNF-α和IL-2 分泌水平高于DC 与CIK 共培养后的相应细胞因子表达（P < 0.01）;KSC-DC-CIK 组和LSC-DC-CIK 组对靶细胞的杀伤率为（50.21±4.24）% 和（49.32±3.89）%,明显高于DC-CIK 组的（30.25±3.11）%（F=89.157,P < 0.01）。结论 CSC 抗原负载DC 活化CIK （CSC-DC-CIK）对同源肿瘤细胞有更好的杀伤作用,对其作用机制和临床应用的可能性尚需深入研究。     

胎儿来源的树突状细胞诱导抗膀胱癌效应的研究

目的：研究胎儿来源的树突状细胞（DC）体外诱导抗膀胱癌的特异性细胞免疫的效果.方法：从胎儿骨髓获得单个核细胞,经粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-4和TNF-α诱导产生DC.利用50%～70%硫酸铵饱和沉淀法获取膀胱癌细胞系EJ含热休克蛋白（HSP）成分的细胞溶解物,以该抗原负载DC,激活胎脾细胞产生肿瘤特异性的细胞杀伤性T淋巴细胞（CTL）.利用IL-2刺激胎脾细胞产生LAK细胞.应用MTF法分别检测CTL和LAK细胞对EJ细胞的杀伤效应.结果：胎儿骨髓可诱导出功能成熟的DC,高表达CD1a、CD86、HLA-DR和CD83.负载EJ抗原的DC可诱导产生CD8＋CTL.其对EJ细胞的杀伤作用明显强于LAK细胞.结论：含HSP成分的肿瘤细胞溶解物负载胎儿来源的DC,体外可诱导出更强的特异性抗肿瘤免疫应答.     

恶性腹腔积液来源的树突状细胞与CIK共培养后对结肠癌细胞体外杀伤作用的研究

目的探讨恶性腹腔积液来源的树突状细胞（DC）与CIK细胞共培养后对SW620结肠腺癌细胞的体外杀伤作用。方法分离15例结肠癌患者的腹腔积液培养获得成熟DC,分离健康人外周血培养获得CIK细胞,DC细胞与CIK细胞共培养,流式细胞仪鉴定表型,MTT法检测各组对结肠癌细胞的体外杀伤作用。结果恶性腹腔积液中存在DC前体细胞,经体外细胞因子诱导培养后可获得成熟的DC细胞,高表达HLA—DR、CD80、CD83、CD86分子。DC与CIK共培养对SW620结肠腺癌细胞的杀伤作用较单独CIK组有明显差异（P〈0．05）。结论腹腔积液中存在DC前体细胞在体外诱导培养可获得功能正常的成熟DC细胞,与CIK共培养后可增强其体外杀伤毒性。     

来源于干细胞的树突细胞激活免疫细胞对同源白血病干细胞的杀伤作用

目的:探讨白血病干细胞(LSC)来源的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养对自身LSC的杀伤作用.方法:提取慢性粒细胞白血病加速期(CML-AP)患者的骨髓单个核细胞(BMMC),再应用CD34+CD38CD44+标记BMMC,流式分选仪分选出LSC并扩增、诱导出DC.取同源的单个核细胞诱导出CIK.用流式细胞技术检测DC和CIK细胞免疫表型、DC的p-糖蛋白(P-gp)耐药蛋白表达.荧光原位杂交(FISH)技术检测BCR/ABL融合基因在LSC及DC中的表达,乳酸脱氢酶释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤效应.结果:CIK与DC共培养后,CD40、CD80、CD83及人类白细胞抗原(HLA-DR)的构成均高于共培养前;CD3、CD3CD8、CD3CD56的成熟表型表达率高于共培养前,差异有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01).干细胞来源DC的P-gp表达阳性率为(60.61±12.38)％.3种效靶比对应的杀伤率差异有统计学意义(P＜0.01),随着效靶比的增加,细胞杀伤作用增强.结论:白血病干细胞来源DC功能正常,与CIK共培养对自身LSC有杀伤作用.     

负载冻融抗原的DC诱导特异性CTL杀伤胃癌细胞的实验研究

目的 研究负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对胃癌细胞的体外杀伤作用.方法 冻融法获取胃癌细胞抗原,联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导培养外周血BC并负载肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,制备特异性CTLs,MTT法检测对胃癌细胞的体外杀伤作用.ELISA法检测γ干扰素(IFNγ)分泌情况.结果 负载胃癌抗原的DC激活的CTLs表现出对胃癌细胞的特异性杀伤作用,产生高水平的IFNY(P<0.01);而对B16黑色素瘤细胞没有杀伤作用不产生高水平的IFNγ.未负载胃癌抗原DC刺激的CTLs对胃癌细胞无杀伤作用.结论 应用细胞因子从人外周血中诱导的DC负载胃癌抗原后,激活的CTLs在体外对胃癌细胞能产生高效而特异性的杀伤作用.     

丁苯酞对神经干细胞向神经细胞分化的促进作用

目的 研究丁苯酞通过PI3K-AKT信号通路促进神经干细胞向神经细胞分化的作用。方法 分离培养SD大鼠胚胎脑皮质层的神经干细胞,采用分化专用完全培养基培养后,通过光镜下观察和Nestin蛋白免疫荧光法进行鉴定。设置对照组和实验组,其中实验组添加丁苯酞辅助分化,分为丁苯酞低剂量组（1 μmol·L^-1）、中剂量组（5 μmol·L^-1）和高剂量组（10 μmol·L^-1）,作用24 h后,CCK-8法检测神经干细胞的细胞活力,碱性磷酸酶染色法检测神经干细胞的分化能力,免疫荧光法检测神经细胞分化程度,RT-qPCR法检测转录因子SOX2、PAX6和NeuN的mRNA表达水平,Western-blot及RT-qPCR检测PI3K-AKT信号通路的表达。结果 丁苯酞干预后神经干细胞活力提高,分化能力提高,碱性磷酸酶试验呈强阳性,转录因子SOX2、PAX6和NeuN的mRNA表达水平增高,PI3K-AKT信号通路蛋白和mRNA表达水平均增高,且呈现剂量依赖性。结论 丁苯酞可以促进神经干细胞向神经细胞分化,其作用机制可能与PI3K-AKT的激活有关。     

新生儿脐血与成人外周血细胞比较分析

目的:比较新生儿脐血与成人外周血细胞性质差异,为干细胞移植提供基础数据。方法:采用全自动血细胞仪对脐静脉血和成人外周血进行分析。结果:脐静脉血中有核细胞数目多,红细胞体积较大。结论:脐血里富含干细胞等原始细胞成分。     

Ricin Trafficking in Cells

The heterodimeric plant toxin ricin binds exposed galactosyls at the cell surface of target mammalian cells, and, following endocytosis, is transported in vesicular carriers to the endoplasmic reticulum (ER). Subsequently, the cell-binding B chain (RTB) and the catalytic A chain (RTA) are separated reductively, RTA embeds in the ER membrane and then retrotranslocates (or dislocates) across this membrane. The protein conducting channels used by RTA are usually regarded as part of the ER-associated protein degradation system (ERAD) that removes misfolded proteins from the ER for destruction by the cytosolic proteasomes. However, unlike ERAD substrates, cytosolic RTA avoids destruction and folds into a catalytic conformation that inactivates its target ribosomes. Protein synthesis ceases, and subsequently the cells die apoptotically. This raises questions about how this protein avoids the pathways that are normally sanctioned for ER-dislocating substrates. In this review we focus on the molecular events that occur with non-tagged ricin and its isolated subunits at the ER–cytosol interface. This focus reveals that intra-membrane interactions of RTA may control its fate, an area that warrants further investigation.     

灵芝多糖对肿瘤细胞与内皮细胞相互作用的影响

目的:研究灵芝多糖对肿瘤细胞与内皮细胞相互作用的影响。方法:应用免疫荧光法配合使用显微镜将内皮细胞区分出来后,通过MTT法观察灵芝多糖在内皮细胞增殖分化过程中的作用,并使用相同的方法观察肿瘤细胞的增殖分化过程与灵芝多糖的关系,同时观察灵芝多糖是否干扰2种细胞间产生的黏附作用及迁移反应。结果:内皮细胞的增殖分化过程与灵芝多糖不存在明显联系,肿瘤细胞的增殖分化过程与灵芝多糖也不存在明显联系,即无明显的细胞毒性反应。但灵芝多糖可阻碍2种细胞间产生的黏附作用和迁移反应,减少肿瘤细胞的迁移百分比。结论:灵芝多糖具有抗肿瘤功效,其作用机制为阻碍肿瘤细胞的黏附作用和迁移反应。     

不同来源间充质干细胞定向诱导为神经样细胞的研究

目的:比较不同来源间充质干细胞(MSCs)在体外定向分化为神经样细胞的能力。方法:无菌获取不同来源的MSCs并进行分组。A组:胎儿真皮;B组:胎儿骨髓;C组:成人骨髓。倒置显微镜下观察各组细胞形态并检测其倍增时间。流式细胞术检测各组MSCs的细胞表型和细胞周期。全反式维甲酸(ATRA)诱导各组MSCs在体外分化为神经样细胞,倒置相差显微镜观察神经样细胞的形态,免疫组织化学法和Western blot检测神经元特异性标志—神经丝蛋白(NF)和星形胶质细胞特异性标志—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:不同来源的MSCs具有相似的细胞形态、细胞表型和细胞周期,但是C组MSCs的增殖能力及体外传代能力低于A组和B组。不同来源、不同扩增代数的MSCs在诱导剂的作用下呈现典型的神经样细胞的形态,免疫组织化学显示,NF和GFAP均呈阳性反应。结论:不同来源的MSCs均可以在体外分化为神经样细胞,但不同发育阶段的MSCs体外分化为神经样细胞的能力存在差异。     

Morphologic Evidence of Anti-Tumor Specificity of T Cells Activated by Denritic Cells Derived from Peripheral Blood Mononuclear Cells of Thyroid Cancer Patients

Recent studies suggest that immunization with autologous dendritic cells (DCs) results in protective immunity and rejection of established tumors in various human malignancies. The purpose of this study is to determine whether DCs are generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMNs) by using cytokines such as F1t-3 ligand (FL), granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), IL-4, and TNF-α, and whether cytotoxic T cells activated against the thyroid cancer tissues by the DCs. Peripheral blood was obtained from 2 patients with thyroid cancer. DCs were established from PBMNs by culturing in the presence of FL, GM-CSF, IL-4, and TNF-α for 14 days. At day 14, the differentiated DCs was analyzed morphologically. The immunophenotypic features of DCs such as CDla, CD83, and CD86 were analyzed by immunofluorelescence microscopy. At day 18, DCs and T cells were incubated with thyroid cancer tissues or normal thyroid tissues for additional 4 days, respectively. DCs generated from the PBMNs showed the typical morphology of DCs. Activated cytotoxic T lymphocytes (CTLs) were observed also. DCs and the CTLs were attached to the cancer tissues on scanning electron microscope. The DCs activated the CTLs, which able to specifically attack the thyroid cancer. This study provides morphologic evidence that the coculture of T cells/cancer tissues activated the T cells and differentiated CTLs. The CTLs tightly adhered to cancer tissues and lysed cancer tissues vigorously. Therefore DCs could be used as potential vaccines in the immunotherapy.     

Effect of Low Dose Radiation on Differentiation of Bone Marrow Cells into Dendritic Cells

Low dose radiation has been shown to be beneficial to living organisms using several biological systems, including immune and hematopoietic systems. Chronic low dose radiation was shown to stimulate immune systems, resulting in controlling the proliferation of cancer cells, maintain immune balance and induce hematopoietic hormesis. Since dendritic cells are differentiated from bone marrow cells and are key players in maintaining the balance between immune activation and tolerance, it may be important to further characterize whether low dose radiation can influence the capacity of bone marrow cells to differentiate into dendritic cells. We have shown that bone marrow cells from low dose-irradiated (γ-radiation, 0.2Gy, 15.44mGy/h) mice can differentiate into dendritic cells that have several different characteristics, such as expression of surface molecules, cytokine secretion and antigen uptake capacity, when compared to dentritic cells differentiated from the control bone marrow cells. These differences observed in the low dose radiation group can be beneficial to living organisms either by activation of immune responses to foreign antigens or tumors, or maintenance of self-tolerance. To the best of our knowledge, this is the first report showing that total-body low dose radiation can modulate the capacity of bone marrow cells to differentiate into dendritic cells.